Documente online.
Username / Parola inexistente
  Zona de administrare documente. Fisierele tale  
Am uitat parola x Creaza cont nou
  Home Exploreaza
Upload



















































Lipide microbiene

biologie












ALTE DOCUMENTE

VITAMINE LIPOSOLUBILE
Celula-unitatea structurala si functionala a lumii vii
Senzatiile
Microscopul Optic
GENETICA
TEST DE EVALUARE SUMATIVA - SISTEMUL RESPIRATOR
Rolul biologic al proteinelor
Cafeaua - de la arbore la ceasca
INFLUENTELE MEDIULUI INCONJURATOR IN APARITIA BOLILOR PARAZITARE

Lipide microbiene



6.1. Introducere

    Este cunoscut de mult timp faptul ca microorganismele sunt capabile sa produca lipide. Pentru a se pastra analogia cu plantele din care se extrag uleiurile, aceste microorganisme au fost denumite oleaginoase. Doar uleiurile foarte valoroase pot fi obtinute prin procese biotehnologice, deoarece īn cazul uleiurilor obisnuite, pretul de cost este superior produselor similare obtinute prin procedeele clasice.

Piata comerciala a uleiurilor vegetale continua sa fie dominata de uleiul de soia (productia    mondiala īn 1993 18·106 t fata de 6·106 t īn 1983) [[1]]. Pretul untului de cacao a variat īntre 3000 si 8000 $ S.U.A. per tona (vrac). Mentinerea unui pret pe tona īn jurul valorii maxime face ca metodele biotehnologice sa de obtinere a triacilglicerolilor sa devina promitatoare, mai ales īn cazul utilizarii ca sursa de carbon a apelor reziduale din diverse industrii.

    O alta oportunitate pentru procesele biotehnologice o constituie uleiurile utilizate īn īngrijirea sanatatii cum ar fi uleiurile polinesaturate. Dintre acestea trebuie mentionate acidul γ-linoleic (18:3 ω-6), acidul arachidonic (20:4 ω-6), acidul eicosapentanoic (20:5 ω-3), etc [[2]].

    Lipidele cu valoare foarte ridicata sunt compusi prostanoidici cum ar fi prostaglandinele, leukotrienele si tromboxanii, folositi īn special īn scopuri terapeutice experimentale. Ţinānd seama de utilizarile acestor compusi cantitatile necesare sunt de ordinul cātorva kg/an.

6.2. Scurt istoric

Prima referinta la uleiurile microbiene apare īn lucrarea lui Nägeli si Loew "Uber die Chemische Zussammensetzung der Hefe" publicata īn 1878 [[3]]. Prima fractionare a unui amestec de lipide microbiene a fost realizata de Hinsberg si Roos īn 1903. Ei au identificat un acid gras saturat cu formula C15H30O2 (probabil un amestec de acizi miristic si stearic) alaturi de doi acizi nesaturati din care unul era acidul oleic, iar celalalt un acid gras C12. "Colesterolul" sau mai probabil ergosterolul a fost de asemenea identificat īn lipidele extrase.

Prima biotehnologie de obtinere a grasimilor si uleiurilor din Torula    a fost realizata de Lindner la Berlin īn 1890. Procesul a fost dezvoltat la scara pilot īn 1914-1918 cu Trichosporon pullulans īn īncercarea de a gasi o sursa alternativa de grasimi īn    timpul primului razboi mondial.

Conceptele dezvoltate de Lindner au stat la baza elaborarii biotehnologiilor de obtinere a uleiurilor si 525j91f grasimilor microbiene. Este demn de mentionat faptul ca īn 1937 Fink a ajuns la concluzia ca obtinerea industriala a lipidelor microbiene este neatractiva īn viitorul apropiat. Odata cu izbucnirea celui de-al doilea razboi mondial cercetarea īn acest domeniu a fost din nou intensificata īn Germania īn cadrul a doua companii Zellstoff Fabrik īn Maaheim-Waldorf si Henkel et Cie GmbH īn Dusseldorf. Prima companie si-a orientat eforturile catre Candida utilis īn timp ce ultima s-a concentrat asupra genului Fusarium. Īn aceasta perioada s-a facut si trecerea de la cultura de suprafata la cultura submersa. Nici unul din aceste procese nu a constituit un succes deplin, producāndu-se doar cantitati mici de grasimi microbiene ce au fost folosite īn hrana cailor.

Dificultatile īntāmpinate īn dezvoltarea tehnologiilor pentru obtinerea grasimilor microbiene au fost īn principal de natura tehnica, deoarece nu exista o tehnologie eficienta pentru producerea unor cantitati mari de biomasa bogata īn grasimi.

Aceasta problema a putut fi depasita īn momentul dezvoltarii biotehnologiilor pentru obtinerea antibioticelor īn cultura submera si apoi a proteinelor monocelulare.

Prof. F.Lynen a primit premiul NOBEL pentru chimie īn 1964 pentru studiile legate de biosinteza lipidelor microbiene [7].

6. 3. Microorganismele producatoare   

Principalele microorganisme producatoare de lipide microbiene sunt eucariote (alge, drojdii si fungi), desi au fost identificate si cāteva bacterii cu continut ridicat de lipide. Bacteriile acumuleaza īn special ceruri si poliesteri.

   

Tabelul 1. Distributia acizilor grasi din cāteva drojdii.

Organism

14:0

16:0

16:1

18:0   

18:1

18:2

18:3

Candida utilis

-

11

-

1

24

39

25

C. utilis

-

18

-

-

42

34

-

Cryptococcus terricolus

-

18

1

6

60

12

2

Debaryomyces hansenii

-

24

3

8

50

3

2

Hansenula anomala

3

35

2

36

3

-

3

Kluyveromyces polysporus

11

13

51

1

21

-

-

Lipomyces lipofer

1

36

3

21

44

5

-

Lipomyces starkevi

-

40

6

5

44

4

-

Pichia fermemans

-

9

19

-

22

30

16

Pullaria pullulans

-

31

3

9

42

13

1

Rhodosporidium toruloides

1

25

1

13

46

12

2

Rhodotorula graminis

1

30

2

12

36

15

4

Saccharomyces carlsbergensis

-

7

58

2

34

-

-

S. cerevisiae

1

13

37

5

44

-

-

S.fragilis

3

19

12

3

27

25

10

Schizosaccharomyces pombe

0

8

0

0

89

0

0

Trichosporon cutaneum

-

30

-

13

46



11

-

Trigonopsis variabilis

-

19

34

-

23

22

-

Desi continutul de grasimi (raportat la substanta uscata) atinge 70% pentru unele drojdii fiind chiar mai mare pentru cāteva ciuperci, unul din factorii cheie ai realizarii unui bioproces atractiv economic īl constituie randamentul de transformare a substratului īn lipide. Īn aceasta privinta drojdiile sunt superioare fungilor. Randamentul teoretic de transformare a unui substrat de tipul glucozei īntr-o substanta de tipul trioleinei este aproximativ 33% (g/g), presupunānd ca nu se formeaza alte componente celulare. Cum celula microbiana contine si proteine, acizi nucleici si glucide, randamentul real este mult mai redus. Īn cazul fungilor, au fost rareori semnalate randamente mai mari de 18-20%, īn timp ce pentru drojdii randamentele de transformare depasesc īn mod normal 20% (26% pentru Candida curvata) cu o medie de 22-23% atunci cānd sursa de carbon este glucoza, lactoza, xiloza sau zaharoza. Au fost obtinute randamente mai mari cānd s-a utilizat ca sursa de carbon etanolul.

Tabelul 2. Raporturile procentuale dintre acizii grasi nesaturati sintetizati de unele specii de fungi.

Organism

≤12:0

14:0

16:0

16:1

18:0

18:1

18:2

18:3

20:4

Phycomycetes

Conidiobolus denaesporus

1

15

10

5

3

15

2

2a

9

Cunninghamella echinulata

-

1

19

2

7

55

11

6a

-

Entomophthora coronata

40

31

9

-

2

14

2

1a

1

Mucor mucedo

-

1

17

1

11

31

33

6a

-

Rhizopus arrhizus

-

1

18

4

11

30

16

-

-

Saprolegnia parasitica

-

7

18

2

3

20

14

3 a

10

Ascomycetes

Aspergillus niger

-

2

22

3

5

7

46

11

1

Botyritis cinerea

-

3

19

1

4

11

16

42

-

Fusarium moniliforme

-

2

14

-

11

30

42

1

-

Microsporium gypseum

-

-

17

-

8

10

64

-

-

Penicillium chrysogenum

-

3

13

-

12

19

43

6

-

P. notatum

-

-

20

3

6

14

54

2

-

Stilbella thermophila

-

2

43

2

14

25

14

-

-

Basidiomycetes




Agaricus campestris

3

2

12

-

6

3

63

-

-

Fames sp.

1

2

12

2

3

4

70

4

-

Tricholoma nudum

-

1

29

2

13

33

35

26

-

a acid γ-linolenic, 18:3 (6,9,12)

Cea mai mare productivitate s-a obtinut utilizānd sistemul de cultivare continua. Cultivarea drojdiilor īn sistem continuu este mai simpla decāt īn cazul fungilor si de aceea este preferat. Totusi, tinānd seama de spectrul larg de acizi grasi ce pot fi obtinuti si īn special de posibilitatea obtinerii acizilor grasi cu catena mai scurta prin cultivarea fungilor, acestia nu pot fi eliminate din competitie. Unele specii din familia Enthomophorales pot produce acizi grasi ≤C14 pāna la 70% din continutul total de acizi grasi. Principalul dezavantaj consta īn distributia larga a catenei (C8-C14). Fungii din familia Phycomycete pot produce acizi grasi polinesaturati.

Īn literatura exista numeroase date privind cultivarea drojdiilor īn sistem continuu sau fed-batch īn scopul obtinerii lipidelor microbiene. Īn ultimul caz, utilizāndu-se drojdia Lipomyces starkeyi pe substrat etanol s-a obtinut o concentratie celulara de 154 (g/l) cu un continut de lipide de 54%.

6. 4. Acumularea lipidelor

    Desi ca orice    organism viu si microorganismele contin īntotdeauna lipidele necesare functionarii membranelor, nu toate microorganismele pot fi considerate surse de lipide.

    Practic, sunt denumite oleaginoase, microorganismele ce contin peste 20-25% lipide. Boulton si Ratledge [[4], [5]] au corelat capacitatea de acumulare a lipidelor cu activitatea citrat liazei, enzima din ciclul ATP care participa la formarea acetil CoA din citrat conform ecuatiei globale:

citrat +ATP+ CoA ą acetilCoA+oxaloacetat +ADP +Pi

(1)

    Activitatea citrat liazei reprezinta un indicator foarte important asupra capacitatii unui microorganism de a acumula lipide, cu atāt mai mult cu cāt citrat liaza nu este prezenta īn drojdiile neoleaginoase si nici īn cazul tulpinilor neoleaginoase ale unor specii carora le apartin si tulpini oleaginoase cum ar fi Lipomyces starkeyi si L. lipofer.

    Din 600 de specii de drojdii, numai 25 sunt capabile sa acumuleze mai mult de 20% lipide, iar din cele 60.000 de specii de fungi doar 50 acumuleaza mai mult de 25%.

Spectrul acizilor grasi care apar īn drojdii este mult mai īngust decāt cel al acizilor grasi din bacterii, neexistānd acizi grasi cu catena ramificata. Doar cāteva specii de drojdii (īn special cele din genul Torulopsis) produc hidroxiacizi grasi. Acizii grasi (Tabelul 2 ) au de obicei 16-18 atomi de carbon. Drojdiile ca si alte organisme eucariote īsi sintetizeaza acizii grasi nesaturati pe calea acidului oleic, care de obicei este cel mai abundent īn celula.

Drojdiile produc si acizi grasi polinesaturati, desi S.cerevisiae nu poate produce nici acid cis,cis-linolenic, 18: (9,12), nici acid a-linolenic, 18:3 (9,12,15) care apar īn cele mai multe din celelalte drojdii.

Toti acizii grasi sintetizati de drojdii au fost identificati si īn lipidele din plante. Īn toate microorganismele, acizii grasi sunt esterificati sub forma triacilglicerolilor, fosfolipidelor, etc. Principala forma de stocare a lipidelor īn organismele eucariote este reprezentata de triacilgliceroli. Distributia acizilor grasi īn esteri este aceiasi cu cea din uleiurile vegetale, īnsa se constata absenta aproape totala a acizilor saturati C16 si C18 īn pozitia sn-2. Structura resturilor acil legate īn celelalte doua pozitii a fost mai putin studiata. Īn lipidele din Lipomyces lipofer īn pozitiile sn-1 si sn-3 au fost identificati acizii 16:0, 18:1 si 18:2.

Īn schimb, fosfolipidele din drojdii au fost intens studiate. Cele mai importante (tinānd seama de ordinea raspāndirii) sunt fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilinozitol si fosfatidilserina. Din S.cerevisiae au fost izolate cadiolipina (Figura 1) si lisofosfatidilcolina (care are īn locul gruparii acil din pozitia sn-2 o grupare hidroxil libera).

Figura 1.    Cardiolipina..

30 precursoare a sterolilor.

Drojdiile, īn special cele apartinānd genurilor Rhodotorula, Cryptococcus si Sporobolomyces, produc o varietate de pigmenti carotenoizi galbeni (β-caroten) sau rosii (torularodin) ceea ce face ca mediul de fermentatie sa fie colorat. Astaxantina este responsabila pentru culoarea roz-flamingo a Phaffia rhodozyma (Figura 3).

Figura 2    Steroli din drojdii: ergosterol (stānga), zimosterol (dreapta).

Figura 3. Carotenoizi din drojdii; de sus īn jos β-caroten, β-torularodina, astaxantina..

Īn culturile de drojdii apar ca lipide extracelulare sfingolipidele de tipul ceramidei si glicolipidele.

Au fost de asemenea separati diferiti derivati acilati ai manozei, arabitolului, xilitolului si soforozei. Gruparile acil sunt de obicei hidroxi acizi de tipul 16:0 (3-OH), 18:0 (3-OH), 22:0 (13-OH), 18:0 (17-OH), sau polihidroxiacizi cum ar fi acidul 8,9,13-trihidroxidocosanoic cu diverse grade de acetilare si acilare.

Pentru acumularea lipidelor īn microorganismele oleaginoase acestea sunt cultivate īntr-un mediu cu un raport mare C/N. Dupa primele 24 de ore de crestere echilibratǎ, cānd nutrientii se aflǎ īn exces, sursa de azot (de obicei NH4+) este consumata integral. Īn aceastǎ perioadǎ nu are loc nici-o acumulare de lipide. Dupa o perioadǎ de aproximativ 6 ore cānd rezerva de azot a celulei (formatǎ īn cea mai mare parte din amino acizi) este consumatǎ, biosinteza proteinelor si acizilor nucleici īnceteaza complet, dar sursa de carbon continua sa fie asimilata īn continuare. Prin transformarea zaharurilor īn lipide, celula se va umfla cu picaturi de lipide [[6]] si astfel va deveni "obeza" asemanator animalelor superioare (Figura 4).

Figura 4. Cryptococcus curvatus (Candida curvata=Apiotrichum curvatum) crescutǎ timp de 48 de ore pe mediu cu limitare de azot; se observǎ prezenta picǎturilor de grǎsime (continut de lipide aprox. 40%); lungimea barei de marcare =1 mm.

Acumularea lipidelor īn drojdii corespunde deci unui model cinetic bifazic si nu este legata de cresterea celulara. Īn cazul fungilor, care au o viteza specifica de crestere mai redusa , viteza de crestere a biomasei coincide cu viteza de acumulare a lipidelor (Figura 5).

Figura 5.     Dinamica consumului de azot, cresterii biomasei si acumularii lipidelor pentru cultivarea drojdiilor     oleaginoase (stānga) si    fungilor (dreapta) īn sistem discontinuu..

Epuizarea altor nutrienti Mg2+, PO43- (cu exceptia carbonului si oxigenului) poate determina de asemenea acumularea lipidelor, dar īnmultirea celulelor este cel mai usor influentata de sursa de azot.

Figura 6. Variatia concentratiei biomasei, azotului si lipidelor (intracelulare) cultivarea drojdiilor īn sistem continuu..

Utilizānd un mediu de cultura cu raport C:N 50:1 Ratledge [1, 3] a reusit obtinerea biomasei cu continut mare de lipide la o dilutie de 25-30% din viteza specifica maxima de crestere (Figura 6). Īn aceste conditii, concentratia de azot este practic zero, iar organismul are un timp de stationare suficient pentru a asimila excesul de carbon si a-l transforma īn lipide.

    Initial s-a considerat ca raportul exact C:N ales pentru mediul de cultura este de mica importanta cu conditia ca azotul sa fie nutrietul limitativ si sa existe suficient carbon pentru a permite o buna acumulare a lipidelor. Cu toate acestea, s-au obtinut randamente diferite īn lipide cu drojdia Apiotrichum curvatum, īn cultivare continua prin variatia raportului C:N īn mediul de crestere.

    Īntre raportul carbon azot si viteza maxima de crestere (dilutie) pe care organismul o poate atinge exista o relatie de tipul unei curbe hiperbolice; cea mai scazuta viteza de crestere s-a atins la cel mai mare raport C:N (50:1), ceea ce determina cantitatea de lipide produsa si eficienta transformari exprimata ca [g lipide/g glucoza folosita].

Concentratia maxima de lipide īn celula ( 50% g/g) s-a obtinut la un raport C:N de 50: sau mai mare, proportia optima pentru o productivitate maxima (g lipide/l/h) a fost de 25:1, atunci cānd sursa de carbon a fost glucoza si de 30-35:1 atunci cānd s-a utilizat zerul. Rezultate similare au fost obtinute si cu tulpina Rhodotorula glutinis.

S-a observat ca īn cazul tulpinii Apiotrichum curvatum are loc o acumulare simultana īn celula de 50% lipide si aproximativ 20% zaharuri. Acumularea zaharurilor este datorata unei īntārzieri īn sinteza lipidelor dupa initierea asimilarii sursei de carbon.

La Apiotrichum curvatum a fost identificat polizaharidul care s-a acumulat ca fiind glicogenul. Īn ipoteza ca s-ar putea preveni biosinteza polizaharidului care este ca si lipidele o substanta de rezerva, atunci teoretic s-ar putea creste cantitatea totala de lipide produsa īn celula.

6. 5. Biochimia formarii lipidelor īn microorganismele oleaginoase

[7]].

    Din punct de vedere structural, acetil-CoA carboxilaza este o enzima complexa: au fost identificate 3 componente functionale si anume biotin proteina transportoare de carboxil (BCCP), biotin carboxilaza si carboxil transferaza [[8]].

Biotin-BCCP + HCO3- + H+ + ATPCarboxibiotin-BCCP + ADP + Pi

(2)

Carboxibiotin-BCCP + Acetil-CoA Biotin-BCCP + Malonil-CoA

(3)

Deci enzima catalizeaza carboxilarea acetil-CoA, pentru a sintetiza malonil -CoA, reactia avānd loc īn doua etape (2+3) fiind dependenta de prezenta ATP.

Pentru reglarea activitatii enzimei au fost propuse mai multe mecanisme: activarea prin intermediari ai ciclului acizilor tricarboxilici, inhibitia prin esterii acil-CoA cu acizi grasi cu catena lunga, sau fosforilarea reversibila.

Este posibila de asemenea activarea allosterica a acetil-CoA carboxilazei prin citrat. Un alt mecanism de reglare a fost propus pe baza observatiei ca esterii acil-CoA cu catena lunga inhiba acetil CoA carboxilaza din diverse surse. Este īnsa posibil ca actiunea inhibitoare a acestor esteri sa fie nespecifica, datorāndu-se proprietatilor lor tensioactive.

Malonil-CoA, obtinuta din reactia acetil-CoA carboxilazei, este folosita īn sinteza acizilor grasi saturati cu catena lunga printr-o serie de reactii care necesita NADPH si acetil-CoA, catalizate de complexul acid gras sintetaza. Structura complexului enzimatic este diferita īn functie de sursa de provenienta, dar secventa reactiilor este īn principiu similara pentru toate organismele:

Acetil Transacilarea (reactia de initiere)

Me COSCoA + HS-enzima MeCOS-enzima + CoASH

(4)

Malonil Transacilarea

HO2C-CH2COSCoA + HS-enzimaHO2C-CH2COS-enzima + CoASH

(5)

Condensarea cu b-Cetoacil Sintaza

HO2C-CH2COS-enzima + MeCOS-enzima HS-enzima + CO2 + MeCOCH2S - enzima

(6)

Reducerea b-Cetoacil

MeCOCH2S - enzima + NADPH MeCHOHCH2COS - enzima + NADP+

(7)

Deshidratarea b-Hidroxiacil

MeCHOHCH2COS - enzima H2O + MeCH=CH-COS-enzima

(8)

Reducerea 2,3-trans-enoilacil

MeCH=CH-COS-enzima + NAD(P)H MeCH2CH2COS-enzima + NAD(P)

(9)

Deoarece produsul final din ecuatia (9) devine substrat īn ecuatia (6) unde reactioneaza cu o alta molecula de malonil-S-enzima, rezultatul concret al fiecarui ciclu de reactii este introducerea a doi atomi de carbon suplimentari īn gruparea acetil initiala. Acesti atomi de carbon suplimentari sunt ei īnsisi obtinuti din acetil-CoA substrat al acetil CoA carboxilazei. Dupa 7 repetari ale ciclului, este sintetizata palmitoil-CoA cu urmatoarea stoechiometrie:

MeCOSCoA + 7(HO2CCH2COSCoA) + 14NADPH + 14H+

Me(CH2)14COSCoA + 7CO2 /CoASH + 14NADP+ 6H2O

(10)

Natura produsilor finali din complex este determinata īntr-o mare masura de specificitatea de substrat a β-cetoacil-sintazei. De exemplu, propionil-CoA poate īnlocui acetil CoA īn reactia de initiere, ceea ce are drept consecinta sintetizarea acizilor grasi cu numar impar de atomi de carbon. Acid gras sintetazele din microorganismele eucariote sunt organizate structural si functional īn complecsi nedisociabili. Aceste sintetaze numite de tip I constau din copii multiple a doar doua polipeptide multifunctionale. Prezenta proteinei transportatoare de acil a fost confirmata īn sintetazele de tip I prin detectarea 4-fosfopantoteinei care este gruparea prostetica a proteinei transportatoare de acil.

Scindarea citratului pare a fi etapa determinanta de viteza īn biosinteza lipidelor, fiind supusa inhibitiei prin feed-back de catre esterii grasi ai acetil CoA. Transportul citratului īn afara mitocondriilor este si el inhibat de acesti compusi, cele doua etape (transportul si scindarea citratului) fiind intim legate.

Figura 7. Biosinteza lipidelor din glucozǎ..

Acetil CoA rezultata prin scindarea citratului constituie substratul pentru biosinteza acizilor grasi. Unele studii indica existenta unei activari a acetil CoA de catre citrat ceea ce are importanta fiziologica īntrucāt concentratiile de citrat īn drojdiile oleaginoase sunt mai mari decāt īn cele neoleaginoase.

Asa cum se poate observa din Figura7, un alt produs al ciclului este oxaloacetatul. Acesta este transformat īn malat care devine contranion pentru transportul citratului. Malatul mitocondrial este retransformat īn oxaloacetat, asigurāndu-se astfel unul din cele doua substraturi necesare sintezei citratului. Sinteza citratului nu pare a fi un proces care sa necesite adaptarea la anumite conditii.

Malatul este necesar pentru asigurarea iesirii citratului din mitocondrii. Malatul necesar pentru initierea procesului este produs din piruvat prin actiunea enzimei malice. Desi initial s-a crezut ca aceasta enzima ar cataliza transformarea malatului īn piruvat, ea actioneaza īn ambele sensuri.

6. 6. Factorii care influenteaza biosinteza lipidelor

    Sunt multi factori care afecteaza compozitia lipidelor intracelulare si astfel pot provoca o crestere sau o scadere a cantitatii totale de lipide intracelulare. Pentru ca aproape orice schimbare īn conditiile de crestere ale microorganismului poate determina o variatie īn compozitia lipidelor, este necesar sa se tina seama de succesiunea de evenimente care se produc la variatia unui singur parametru īn timpul cultivarii discontinue. De exemplu, īn cazul influentei temperaturii asupra gradului de nesaturare al gruparilor acil grase din lipide, trebuie sa se tina seama ca o scadere a temperaturii va īncetini viteza de crestere a organismului si simultan va duce la cresterea cantitatii de oxigen dizolvat īn mediu. Aceste variatii ale conditiilor de cultivare ar putea sa influenteze starea metabolica a celulelor ceea ce poate determina scaderea sau cresterea pH, necunoscāndu-se care dintre aceste schimbari semnalizeaza efectul variatiei temperaturii.

    Influenta vitezei de crestere asupra acumularii lipidelor īn microorganismele oleaginoase este un factor determinant major al cantitatii de lipide care se acumuleaza intracelular (Figura 6), desi īn organismele eucariote neoleaginoase efectul pare sa fie mai putin evident.

    Cele mai multe experimente s-au facut cu drojdii si majoritatea cu glucoza, uneori cu metanol sau etanol. Glucoza, a carei metabolizare urmeaza calea Embden-Meyerhof, pune cele mai multe probleme pentru microorganismele eucariote, care din acest punct de vedere sunt clasificate ca fiind Crabtree pozitive sau Crabtree negative. Pentru microorganismele Crabtree pozitive, o crestere a concentratiei de glucoza sau orice alt zahar metabolizat pe calea glicolitica are ca rezultat o represie a sintezei enzimelor oxidative (respiratorii) si se manifesta printr-o scadere a consumului de oxigen cuplata cu acumularea de intermediari metabolici redusi, cum este etanolul. S.cerevisiae este o drojdie tipic Crabtree pozitiva; o crestere a concentratiei de glucoza va determina astfel o marire a productiei de etanol chiar īn conditii aerobe. Schimbarile metabolice sunt asociate probabil cu o scadere a componentelor mitocondriale ceea ce conduce la o scadere generala a sumei acizilor grasi, glicerofosfolipidelor si sterolilor esterificati.

    La drojdiile Crabtree negative, cum sunt Candida utilis si Saccharomyces fragilis, se constata o crestere a lipidelor acumulate pe masura ce concentratia de glucoza creste. Cresterea cantitatii de lipide se manifesta īn principal sub forma triacilglicerolilor.

Tabelul 3. Acizii grasi din drojdiile consumatoare de metanol.

Candida guilliermondii

Canida boidinii

Hansenula polymorpha

Microorganism



Substrat

Lipide (%)

Acizi grasi ( %)

14:0

16:0

16:1

18:0

18:1

18:2

18:3

metanol

12,3

-

14

7

1

53

24

2

glucoza

22,2

-

20

9

3

57

9

1

metanol

6

-

19

18

2

30

28

-

glucoza

3,5

1

19

20

5

11

41

-

metanol

1,4

-

15

3

5

38

36

-

glucoza

1,2

-

16

6

8

25

41

-

    Īn cazul drojdiilor consumatoare de metanol care sunt facultativ metilotrofe, apar variatii mari īn ceea ce priveste spectrul de acizi grasi fata de drojdiile crescute pe glucoza (Tabelul 3 ).

    Īn cazul a doua drojdii crescute pe metanol s-au constatat modificari importante īn compozitia fosfolipidelor: au crescut fosfatidil serina si fosfatidil inositolul pe seama fosfatidil colinei [[9], [10]].

    Experimente efectuate īn cultivare fed-batch au demonstrat influenta substratului asupra corelatiei dintre concentratia celulara si continutul de lipide. Astfel, cu tulpina Lipomyces starkeyi cultivata pe substrat etanol s-a obtinut o concentratie a biomasei de 150 g/l si un continut de lipide de 54%. Folosind tulpina Rhodotorula glutinis pe glucoza īn cultivare fed-batch a fost obtinuta o concentratie de biomasa de 181 g/l cu un continut de 43% lipide. Īn aceste cazuri, cresterea a trebuit sa fie sustinuta prin utilizarea de aer īmbogatit cu oxigen (40% oxigen). Pare posibila atingerea unor concentratii celulare de 100 g/l si fara a folosi oxigen suplimentar, cu cele mai multe dintre drojdiile oleaginoase.

    Īn general, gradul de nesaturare al acizilor grasi din sistemele biologice creste pe masura ce temperatura de cultivare scade, observatie valabila atāt pentru organismele procariote [[11]] cāt si pentru cele eucariote [[12]]. Atunci cānd studiile s-au desfasurat īn chemostat, corelatia dintre gradul de nesaturare si temperatura a fost confirmata īn multe cazuri. Dar nu toate organismele prezinta acest comportament; s-au constatat diferente putin semnificative īn gradul de nesaturare al acizilor grasi la Saccharomyces cerevisiae īntre 30 si 15 oC [[13]]; la Candida sp. 107, īntre 19 si 32,8 [[14], [15]], sau la Rhodotorula gracilis īntre 22,5 si 30oC.

[16]].

    La eucariote, oxigenul este necesar pentru transformarea acidului stearic īn acid oleic si apoi īn acizi linoleic si linolenic. Deoarece exista o singura etapa īn biosinteza acizilor grasi care necesita ATP si nici una care sa necesite oxigen direct, este de asteptat ca lipsa oxigenului sa nu conduca la scaderea continutului de lipide din celule, fiind afectat doar randamentul īn biomasa.

2+, PO43- pot determina cresterea cantitatii de lipide acumulate, dar pot de asemenea conduce la modificari ale compozitiei lipidelor īn mod independent de efectul asupra lor asupra acumularii lipidelor. De exemplu, limitarea prin fosfat determina la S.cerevisiae scaderea cantitatii de sterol esterificat si a triacil glicerolilor, independent de cantitatile de fosfolipide [[17]].

    Deficienta inositolului la anumite tulpini de S.carlsbergensis si S.cerevisiae, conduce la o crestere a cantitatii de lipide celulare [[18]]. Se considera ca acest efect este datorat unei cresteri a activitatii acetil-CoA carboxilazei, desi nu se cunoaste exact mecanismul prin care acumularea lipidelor este influentata de deficienta de inositol.

    Pe de alta parte, deficienta de tiamina conduce la S.carlsbergensis la o scadere a cantitatii totale de lipide: sterol esterificati, acil gliceroli, glicofosfolipide [[19]].

6.7. Consideratii tehnico-economice

Evaluarea potentialului pentru obtinerea uleiurilor si 525j91f grasimilor microbiene s-a concentrat asupra posibilitatii utilizarii apelor reziduale ca sursa de carbon pentru obtinerea biomasei cu continut ridicat de ulei. Astfel, zerul din industria laptelui ramas dupa īndepartarea proteinelor contine 5,5% lactoza si reprezinta o sursa de carbon ieftina pentru cultivarea drojdiilor oleaginoase. Cresterea drojdiei Candida curvata D (Apiotrichum curvatum ATTC 20509) a permis obtinerea unei biomase cu 20%(g/g) ulei cu o compozitie apropiata de cea a uleiului de palmier (25% 16:0; 15% 18:0; 49% 18:1; 7,5% 18:3). A fost investigata de asemenea posibilitatea utilizarii xilozei, xilanului si a apelor reziduale din industria lemnului ca substrat pentru dezvoltarea biomasei. Acestea contin aproximativ 40% (g/g) hemiceluloza, -restul fiind celuloza si lignina-    (raportate la substanta uscata) alcatuita īn principal din xilan. Xilanul sau xiloza (produsul de hidroliza al acestuia) sunt la fel de eficiente ca glucoza pentru obtinerea biomasei. S-au obtinut 13,7 g triacilgliceroli din 100g xiloza. Xiloza si xilanul sunt materii prime potentiale ieftine si abundente, care īsi pot gasi īntrebuintarea nu numai īn obtinerea uleiurilor , dar si pentru alte produse biotehnologice.

Calculul economic al proceselor de fermentatie nu este īn favoarea obtinerii biomasei bogate īn uleiuri, daca se ia īn considerare o transformare a substratului īn lipide de numai 20%, asa cum s-a obtinut īn Europa si America de Nord. Costurile de fermentatie sunt de cel putin 1000 DM/ tona de biomasa, ceea ce īnseamna aproximativ 2500 DM / tona de ulei, la un continut de ulei īn biomasa de 40%; la acesta se adauga costurile de prelucrare a biomasei si pretul substratului, ceea ce conduce la un cost total de 5000DM/ tona. Acest cost mai poate fi micsorat daca deseurile celulare bogate īn grasimi pot fi vāndute ca hrana pentru animale. In aceasta alternativa se pot lua īn considerare urmatoarele costuri: 2 tone substrat - 800 DM;     costurile de fermentatie si prelucrare: 1500 DM

Costul total al unei tone de produs care contine 40% ulei si 60% resturi celulare, ar fi de 2300 DM. In conditiile īn care continutul īn proteina al resturilor celulare este de 40-45%, acestea se pot folosi ca aditiv furajer, care se poate vinde cu 500 DM/ tona . Deci din pretul total al unei tone de produs de fermentatie se pot scadea 300 DM, obtinute din folosirea resturilor celulare ca aditivi furajeri proteici, ceea ce conduce la un cost net de 2000 DM pentru o tona produs de fermentatie cu 40% continut īn uleiuri, ceea ce īnseamna 5000DM/ tona de ulei.

Totusi cea mai mare contributie la scaderea pretului o are micsorarea considerabila a costului substratului. Ţinānd cont de aceste considerente, procesele de obtinere a biomasei bogate īn uleiuri care folosesc ca substrat xilanul sau zerul sunt foarte atractive.

Variantele pentru obtinerea economica de biomasa bogata īn uleiuri este fie producerea de uleiuri sau grasimi cu valoare mare de vānzare (5000 DM/ tona sau mai mult) sau utilizarea unor substraturi ieftine sau chiar subproduse poluante rezultate īn alte procese tehnologice.

Biomasa bogata īn uleiuri este o varianta mult mai avantajoasa din punct de vedere economic decāt proteinele monocelulare, pentru care se opta ca varianta de produs biotehnologic īntr-un procedeu de reciclare. Biomasa bogata īn uleiuri are īn primul rānd avantajul fata de proteinele monocelulare de a nu fi folosita ca produs destinat consumului alimentar uman, ceea ce permite utilizarea ca substraturi a unor produse cu costuri zero sau chiar negative, cum ar fi resturile menajere, efluentii poluanti din diverse procese de productie, care nu se pot recircula. Probabil ca pot fi folositi chiar efluenti de la fabricile de producere a uleiurilor sau grasimilor.

Bibliografie



[1]. RATLEDGE ,C.,    Biotechnology    (H.J. REHM, G.REED), VCH Germany, ed a 2-a, vol 7, 133-197 (1997).

[2]. FOX , S. R., HAMBER, G. M., FRIEND, M., RATLEDGE, C., Lipids 35, 1205-12-14    (2000).

[3]. RATLEDGE, C., Fette Seisen Anstrichmittel     86, 379-389 (1984).

[4]. Boulton, C. A., Ratledge, C.,     J. Gen. Microbiol., 127,169-176 (1981).

[5]. Boulton, C. A., Ratledge, C., Top. Enz. Ferment. Biotechnol. 9,11-77 (1984).

[6]. Fukui, S., Tanaka, A., Adv. Biochem. Eng., 19, 217-237 (1981).

[7]. Lynen, F., Eur. J. Biochem., 112, 431-442 (1980).

[8]. Boulton, C. A., RatledGE, C., Comprehensive Biotechnology (M. MOO-YOUNG) vol 1 459-482 (1984).

[9]. Rattray, J. B. M., Schibeci, A., Kidby, D. K., Bacteriol. Rev., 39,197-231 (1975).

[10]. Rattray, J. B. M., Hambelton, J. E., Can. J. Microbiol., 26,190-195 (1980).

[11]. Gill, C. O., J. Gen. Microbiol., 89, 293-298 (1975).

[12]. Brown, C. M., Rose, A. H., J. Bacteriol., 99,371-378 (1969).

[13]. Hunter, K., Rose, A. H., Biochim. Biophys. Acta, 260, 639-653 (1972).

[14]. Hall, M. J., Ratledge, C., Appl. Environ. Microbiol., 33, 577-584 (1977).

[15]. Gill, C.O., Hall, M. J., Ratledge, C.,. Appl. Environ. Microbiol., 33, 231-239 (1977).

[16]. Okuyama, H., Saito, M., J. Biol. Chem., 254,12281-12284 (1979).

[17]. Ramsay, A. M., Douglas, J. L., J. Gen. Microbiol., 110,185-191 (1979).

[18]. Daum, G., Glatzm, H., Paltauf, F., Biochim. Biophys. Acta, 488, 484-492 (1977).

[19]. Nishikawa, Y., Nakamura, I., amihara, T., K., Fukui, S., Biochem. Biophys. Acta, 486, 483-489 (1977).













Document Info


Accesari: 4548
Apreciat:

Comenteaza documentul:

Nu esti inregistrat
Trebuie sa fii utilizator inregistrat pentru a putea comenta


Creaza cont nou

A fost util?

Daca documentul a fost util si crezi ca merita
sa adaugi un link catre el la tine in site

Copiaza codul
in pagina web a site-ului tau.




Coduri - Postale, caen, cor

Politica de confidentialitate

Copyright © Contact (SCRIGROUP Int. 2019 )