Documente online.
Username / Parola inexistente
  Zona de administrare documente. Fisierele tale  
Am uitat parola x Creaza cont nou
  Home Exploreaza
Upload





loading...
















































Spectroscopia prin rezonanta magnetica de spin

biologie


Spectroscopia prin rezonanta magnetica de spin

Este o tehnica spectroscopica care detecteaza speciile atomice ce au un electron nepereche sau numar impar de protoni si are la baza urmatorul principiu: un electron celibatar al unei molecule paramagnetice, sau un nucleu poseda un moment magnetic, in prezenta unui camp magnetic extern, momentul magnetic poate avea doua orientari paralel sau anti paralel (orientari date de valorile numarul cuantic de spin[1]).

Aceste doua stari au energii d 515c26f iferite, tranzitia unei stari in cealalta poate fi indusa sub influenta unei radiatii electromagnetice. Relatia dintre frecventa radiatiei folosita pentru a induce tranzitia dintr-o stare energetica de spin in alta si intensitatea campului magnetic B0 este data de relatia:

(1)

β este magnetonul lui Bohr = 0,92 x 10-23J T, g este o constanta spectroscopica care depinde de mediul in care se gaseste electronul celibatar sau protonul.[50]

Fig.21. Un orbital electronic, complet ocupat cu electroni, unul avand o orientare paralela, celalat anti paralela. Diferenta dintre cele doua stari de spin intr-un camp magnetic este data de relatia (1)

Cu alte cuvinte, in cazul atomilor cu numar inegal de protoni si neutroni, protonul are spin, odata cu el se misca si sarcina electrica, sarcina electrica care in miscare fiind determina aparitia unui curent electric , respectiv un camp magnetic. Astfel protonul are propriul sau camp magnetic, pe care il putem imagina ca pe o mica bara magnetica. In cazul tehnicilor RES se ia in considerare miscarea de spin a electronilor dintr-un orbital semiocupat.

Fig.22 Orientarea in directia liniilor de camp si miscarea de precesie ( miscarea in jurul liniilor de camp cat si in jurul propriei axe) [77]

Aceasta frecventa de precesie nu este constanta, ea fiind direct proportionala cu intensitatea campului magnetic exterior. Calcularea aceste frecvente de precesie se face utilizand relatia: (2), unde ω0 este frecventa de precesie, γ este raportul giromagnetic iar B0 intensitatea campului magnetic.

Rezonanta electronica de spin (RES)

Spectroscopia prin EPR reprezinta studiul moleculelor ce contin electroni impari prin observarea campurilor magnetice la care ei intra in rezonanta cu radiatia de tip microunda, campurile magnetice de cca. 0,3 T ( valoare folosita la majoritatea spectrelor RES comerciale) corespund rezonantei cu un camp electromagnetic de frecventa 10GHz (109 Hz) si lungimea de unda de 3 cm. Intrucat radiatia de 3 cm se incadreaza in banda X a regiunii de microunde a spectrului electromagnetic, RES este o tehnica de microunde.

Camp magnetic B0

 

Frecventa (ν) Microunde (GHz)

 



Fig.23. Benzile specifice regiunii de microunde a spectrului electromagnetic.[72]

Fig. 24. Schema unui spectrometru RES. Un camp magnetic de 0,3T care necesita pentru rezonanta impulsuri de microunde cu frecventa de 9 GHz. [81]

Fig.25 Spectrul RES al anionului C6H6- in solutie fluida, unde a este scindarea hiperfina a spectrului; centrul spectrului fiind determinata de valoarea factorului g [80]

Spectru RES se obtine prin inregistrarea absorbtiei de microunde in timp ce variaza campul.

Moleculele probei trebuie sa posede spini ai electronilor impari, RES fiind per ansamblu o metoda mai putin aplicabila decat RMN.

De mentionat ca studiile RES nu se fac decat in vitro, proba trebuind sa fie liofilizata (indepartarea apei din structura probei, deoarece apa este un puternic absorbant al microundelor, undele folosite pentru inducerea fenomenului de rezonanta)

Exista mai multe tipuri de spectroscopie prin rezonanta paramagnetica de spin, in functie de informatiile culese, cele mai frecvent utilizate pentru studiul dinamicii moleculare fiind:

Multifrequency EPR:

Tehnica este una relativ noua, utilizeaza frecvente paramagnetice inalte (95-700GHz) care corespund unor campuri magnetice de intensitate mare (pana la 25 T) mai este cunoscuta ca HFEPR (Electron paramagnetic resonance at multiple high frequencies)

Fiind folosita pentru studiul chimiei radicalilor organici pentru studiul respectiv se utilizeaza mai multe tipuri de molecule paramagnetice (markeri paramagnetici fiind metale Co, Mn, Fe, etc.), insa referitor la structurile biologice se preteaza cel mai bine la studiul coordinarii metalelor din moleculele complexe.[78]

Fig.26 Banda de frecvente RES, pentru care sau asociat litere in functie de frecventa utilizata [72]



Spectroscopia EPR conventionala:

Cu ajutorul acestei tehnici se poate urmari dinamica proteinelor care contin ioni metalici, radicali organici, intermediari organici via reactii enzimatice, sau orice molecula marcata cu o molecula paramagnetica. Metoda are ca interval de timp pentru saturatia transferului: 0.1 ms < tc < 0.1 m s.

Este cea mai comuna si utilizata metoda RES, moleculele paramagnetice, in cazul studiului probelor biologice se folosesc sonde paramagnetice cel mai adesea radicali nitroxid. Cea mai frecventa sonda EPR este TEMPO (2,2,6,6 trimetilpiperidina N-oxi), dare se folosesc de asemenea si compusi pe schelet de dibutil nitroxid sau piroxil.

TEMPO Dibutil nitroxid piroxil

Fig.27 Sonde paramagnetice [50]

Caracterul sau hidrofob o face solubila la nivelul membranelor. Spectrul sau caracteristic este compus din trei picuri datorita interactiunii electronului celibatar si spinul nucleului de azot. Forma spectrului depinde de mobilitatea sondei, astfel se poate evalua fluiditatea membranara.

Text Box: Intensitate semnal


a. b.

Fig.28. a).Spectrul TEMPO in apa si glicerol b).morfologia in functie de intensitatea campului magnetic folosit. [50,72]

Spectrul depinde atat de polaritatea mediului inconjurator cat si de fluiditatea membranara. Solubilitatea TEMPO in mediul hidrofob este mai ridicata si atunci conformatia lanturilor hidrocarbonate este dezordonata, la limita putem considera ca este ordonata daca sonda este insolubila. Asocierea acestor doua caracteristici permit urmarirea tranzitiilor de faza ordine-dezordine a lipidelor.

Fig.29 Spectrul TEMPO in: a)apa, b)mediu apolar, c)sonda partial dizolvata in membrana.[50]

Inaltimea p se datoreaza prezentei sondei in mediu polar; parametrul f = h/(h+p) fiind proportional cu cantitatea de lanturi dezordonate. Utilizand factorul f se poate urmari tranzitia ordine - dezordine prin culegerea semnalului RPE.

Fig.30 Tranzitia ordine- dezordine in functie de temperatura pentru lipozomi formati din DMPC, DSPC si un amestec echimolar de DMPC si DSPC , urmarita prin semnalul EPR al TEMPO. [50]

In cazul determinarii gradului de ordine molecular membranar se poate apela la studiul spectrului din punctul de vedere al anizotropiei semnalului emis.


a. b.

Fig.31 a).Geometria fosfolipidului marcat paramagnetic si anizotropia semnalului RES , b) pierderea anizotropiei = dezordine[72]

ENDOR (Electron-Nuclear Double Resonance)

Este o tehnica care vine in ajutorul EPR prin RMN. Este utilizata pentru studiul structurii moleculelor paramagnetice, aducand de asemenea informatii despre distanta si mediul din jurul centrilor paramagnetici (proteine, enzime ce pot contine ioni paramagnetici). Aceasta metoda, deoarece examineaza nucleele din vecinatatea electronilor nepereche, poate aduce informatii pe care NMR conventional nu poate datorita timpului scurt de relaxare al acestor nuclee. Tehnica presupune utilizarea a doua frecvente una fixa de microunde, care va duce la o saturare energetica partiala pentru tranzitiile de tip Zeeman, care va monitoriza semnalul EPR si una de radiofrecventa pentru excitarea Zeeman nucleara. La un camp magnetic de 0,34 T, frecventa microundei, pentru un factor g =2, va fi in jur de 9,5 GHz, in timp ce frecventa radio va fi de 14 MHz. Aducand tranzitiile NMR intr-un camp puternic se initiaza o rata nucleara de tranzitie particulara, care este transmisa electronilor (cuplare hiperfina) ducand la variatia ratei de relaxare odata cu modificarea semnalului EPR. Spectroscopia ENDOR se realizeaza pe specii paramagnetice fie in lichide fie in solide. La nivelul lichidelor, spectrul ofera informatii despre cuplarile hiperfine izotropice, pe cand pentru solide se poate observa si cuplarile hiperfine anisotropice. In prealabil spectrele ENDOR au nevoie de simulare pe calculator pentru a se determina precis valorile de interactii hiperfine. Aceasta se face avand la dispozitie o matrice in ochiurile careia se gasesc nucleele, putandu-se in acelasi timp determina distanta si orientarea nucleelor din vecinatatea centrilor paramagnetici.[ 79]

Rezonanta magnetica nucleara:

Spectroscopia de rezonanta magnetica nucleara are la baza absorbtia undelor din domeniul radio (intre 4 si 1000 MHz). Daca in cazul spectroscopiei RES electronii erau implicati in fenomenul de absorbtie al undelor (microunde), in cazul spectroscopiei RMN sunt implicate nucleele atomice.

Fundamentele teoretice ale spectroscopiei RMN au fost stabilite de W. Pauli in 1924, care a sugerat ca anumite nuclelee atomice au proprietati de spin si momente magnetice care odata introduse intr-un camp magnetic va duce la separarea nivelelor lor energetice. Acest postulat a fost verificat in 1946 de Bloch la Stanford si Purcell la Harvard[2], aratand ca absorbtia unei unde electromagnetice intr-un camp magnetic duce la separarea in functie de nivelele energetice. [80].

Intr-un camp magnetic de 1T, energia proprie a nucleului de hidrogen corespunde energiei unei unde cu frecventei de 42,576 MHz (106 s-1), sau altfel spus unei unde radio cu lungimea de cativa metri. Deci RMN spre deosebire de RES este o tehnica de radiofrecvente.

Datorita agitatiei termice, nucleele, intr-un camp magnetic extern se gasesc in stari de energie inalte mai mult (orientarea spinului antiparalel) dar si in stari de energie joase (orientarea spinului paralel). Pe masura ce creste temperatura diferenta dintre cele doua stare scade. La temperatura de 300 de K raportul dintre populatia cu energie joasa si cea cu energie crescuta este de 0.999 993.



Un spectrometru RMN consta dintr-un magnet care poate produce un camp intens, uniform si surse corespunzatoare ale radiatiei electromagnetice de radiofrecvente. In instrumentele simple, campul magnetic este produs de un magnet permanent. Pentru lucrari riguroase se foloseste un magnet supraconductor, capabil sa genereze campuri de 10 T si chiar si mai mari. Proba este pusa intr-un magnet cilindric care se roteste cu cca. 10 Hz pentru a inlatura neomogenitatile magnetice, supunand astfel toate nucleele magnetice la acelasi camp mediu. Desi un magnet supraconductor opereaza la temperaturi de cativa K (4K- temperatura heliului lichid), proba se afla la temperatura camerei sau putin mai scazut. Folosirea campurilor mari are avantajul ca simplifica forma spectrelor, facand interpretarea lor mai facila, de asemenea preluarea energiei de catre proba este mai rapida.

Momentele magnetice nucleare interactioneaza cu campul magnetic local. Campul local poate sa difere de campul aplicat, intrucat, ultimul induce momentul unghiular orbital electronic (principiul metodei ENDOR), conduce la aparitia unui camp magnetic suplimentar, care este direct proportional cu asa numita constanta de ecranare (σ) pentru acel nucleu.

Interpretarea spectrelor RMN se face in functie de deplasarea chimica δ. Aceasta reprezinta diferenta intre frecventa nucleului analizat si aceea a unui standard de referinta.[80] Nucleul de hidrogen prezinta o energie magnetica proprie intr-un camp de 1T, corespunzator unei frecvente de rezonanta de 42,576 MHz. Nucleul din gruparea CH2 a lipidelor membranare si nucleul din molecula de apa au frecvente de rezonanta usor diferite datorita interferentei campurilor atomilor din jur si a campului extern.

Frecventa de rezonanta magnetica nucleara ν0 este proportionala cu campul magnetic B0,

(3)

simplificand obtinem

(4)

Fiecare nucleu, fiind supus in acelasi timp unui camp magnetic extern B0 cat si unui camp local determinat de nucleele din jur, atunci campul efectiv va fi

(5)

iar

(6),

unde ν0 va depinde deci de mediul chimic inconjurator, aceasta dependenta stand la baza studiilor structurale efectuate prin spectroscopie RMN.

Pentru aceasta s-a introdus conceptul de deplasare chimica δ, care exprima variatia frecventei νx intr-un mediu x cu frecventa νref:

(7),

este un numar de ordinul 10-6 si se exprima in parti pe milion (ppm).

Timpii de relaxare T1si T2, urmaresc modul in care scade picul de rezonanta in plane diferite.

Astfel daca la 300K nu exista decat o infima diferenta dintre nucleele situate pe nivele energetice inalte , respectiv joase, intr-un camp magnetic extern, prin transmiterea unui impuls radiativ de radiofrecventa se va ajunge la cresterea numarului nucleelor cu energie ridicata (antiparalel). T1 fiind masura timpului de intoarcere a sistemului la starea initiala de echilibru. Aceasta se face prin schimburi energetice intre spinii nucleelor atomice luate in studiu si atomii din retea care si ei vibreaza datorita agitatiei termice. T1 fiind cunoscut ca timpul de relaxare spin-retea. [82]

Se stie de asemenea ca sub un impuls radio, mai multi spini vor avea un raspuns coerent, adica vor fi in faza. Dupa incetarea impulsului aceasta coerenta se pierde, ceea ce se cheama T2 sau altfel spun timpul de relaxare spin spin. (fig. 32).


Fig.32. Procesele de relaxare nucleara spin-retea si spin- spin [80]

Exista doua tipuri de spectre:

- spectre cu banda larga, pentru care latimea liniilor spectrale mascheaza structura fina a mediului inconjurator.

Fig.33 spectru RMN la rezolutie mica (apa intr-un pahar de sticla) la o frecventa de 5MHz [80]

- spectre de rezolutie inalta, in cazul unor dispozitive care au posibilitatea realizarii unor campuri magnetice mari, poate detecta diferente de frecvente (deplasari chimice) de pana la 0,01ppm).

Fig. 34 Spectre RMN de rezolutie inalta (etanol) la frecventa de 60 de MHz, rezolutie de 10-6, respectiv10-7 [80]



Investigarea dinamicii moleculare si evaluarea fluiditatii membranare cu ajutorul tehnicilor RMN se face prin determinarea compozitiei chimice, a gradului de nesaturare al acizilor grasi, si aprecierea coeficientului de difuziune laterala pentru constituentii membranari.

Determinarea cantitativa cat si calitativa implica cunoasterea deplasarilor chimice fata de grupele metil, metilen, metin.[80]

Tabel.2 deplasarile chimice ale protonilor care apartin gruparilor metil, metilen, metin [80]

In ceea ce priveste determinarea coeficientului de difuziune, s-au facut determinari pentru determinarea coeficientului de difuziune al colesterolului in membrane artificiale. [83]

Fig.35 Spectru RMN al P31 pentru un amestec de DMPC/colesterol/apa [83]

Interactiunea componentilor membranari, intrinseci sau extrinseci, modificarea gradului de ordine/dezordine. De exemplu oligozaharidele, care se pare ca sunt implicate in prezervarea membranara in timpul dezhidratarii prin legarea la lipidele membranare. interactiunea acestora cu lipidele membranare a fost studiata pentru POPC si DMPC prin analiza spectrelor P31 si H2. se pare ca acesti fructani (levan) cresc mobilitatea lanturilor acizilor grasi dar imobilizeaza capurile. [84]

Fig.36 a).spectrul POPC la 60C, b).spectrul POPC la 30C, c) POPC si Levan la 30C, d). POPC si Levan la 60C [84]

De asemenea se pot determina si influentele celorlanti participanti la ansamblul molecular membranar, alte fosfolipide, sfingomielina, sau proteinele. Prezenta sfingomieline influenteaza intr-o masura redusa coeficientul de difuziune laterala lipidica membranara avand o dependenta aproape nula fasa de continutul in colesterol. [85] in ceea ce priveste proteinele, cele transmembranare (gramicidina) au efect obstructiv al difuziunii laterale lipidice regional, ne existand o dependenta liniara.[86]



[1] Niels Bohr a propus un model cuantificat al atomului: electronii se rotesc in jurul nucleului, fara a emite energie radianta si fiind repartizati in straturi succesive, carora le corespunde un sir discontinu de stari (nivele) energetice permise, caracterizate prin numere cuantice. In modelul lui Bohr, electronii se misca pe orbite circulare cu razele cuantificate. Orbitele sunt caracterizate printr-un numar intreg pozitiv, numit numar cuantic principal n. Sommerfeld extinde orbitele circulare la orbite eliptice, nucleul fiind plasat intr-unul din focare. Orbitele pot fi determinate prin doua numere intregi, introducandu-se al doilea numar cuantic, numar cuantic secundar l(azimutal) care poate lua valori intre 0 si n-1. orbita circulara corespunde lui l=n-1. Numarul cuantic principal n caracterizeaza nivelul electronic iar l subnivelele.

Datorita miscarii electronului in jurul nucleului (sarcina electrica in miscare), se genereaza un camp magnetic. Cand atomul este plasat in camp electric (efect Stark) sau in camp magnetic (efect Zeemann) exterior, orbitele se orienteaza in camp. Aceasta orientare e caracterizata printr-un al treilea numar cunatic, numar cuantic magnetic m, care poate lua valori intregi cuprinse intre l si +l adica 2l+1 valori.

Datorita rotatiei electronului in jurul axei proprii apare un moment cinetic, acestuia ii corespunde un numar cuantic de spin s , care poate lua valorile 1/2, in functie de sensul de rotatie [76]

[2] In 1952 celor doi le-a fost decernat premiunl Nobel


loading...




Document Info


Accesari: 3874
Apreciat:

Comenteaza documentul:

Nu esti inregistrat
Trebuie sa fii utilizator inregistrat pentru a putea comenta


Creaza cont nou

A fost util?

Daca documentul a fost util si crezi ca merita
sa adaugi un link catre el la tine in site

Copiaza codul
in pagina web a site-ului tau.




Coduri - Postale, caen, cor

Copyright Contact (SCRIGROUP Int. 2017 )