Documente online.
Username / Parola inexistente
  Zona de administrare documente. Fisierele tale  
Am uitat parola x Creaza cont nou
  Home Exploreaza
Upload



















































Imobilizarea enzimelor

medicina












ALTE DOCUMENTE

PATOLOGIA TIROIDIANĂ
Vegetatiile veneriene - Negii genitali
LUPTA CU HIV/SIDA si pe teritoriul stomatologiei
PSIHOTERAPII DE ORIENTARE COMPORTAMENTALĂ
EXPLORAREA RADIOIMAGISTICA A PLAMANULUI
CONDIŢIILE PE CARE TREBUIE SĂ LE ÎNDEPLINEASCĂ INTERVENŢIA PSIHOTERAPEUTICĂ PRIN PARADOX
PROIECT - În cautarea propriei sanatati
Fibroelastoza endocardica
Virozele cutaneo-mucoase
Vulvo-Vaginitele

 

2. Imobilizarea enzimelor

 



 

 

Imobilizarea poate fi definita ca o captare a unei molecule de enzima într-o faza distincta care permite schimburi cu substratul, dar este separata de acesta.

Enzimele se denumesc imobilizate daca sunt legate chimic sau prin adsorbtie de diverse materiale suport (matrici), sau entrapate în forma solubila în microcapsule sau membrane impermeabile pentru enzima si care permit un schimb continuu de substrat sau produs.

Pentru ca utilizarea imobilizatelor sa fie eficienta, acestea trebuie sa îndeplineasca o serie de cerinte:

·        densitatea biomoleculelor imobilizate sa fie mare

·        sa prezinte o mare activitate enzimatica

·        sa fie stabile la temperatura si timp

·        sa permita o buna accesibilitate analitilor chimici

·        sa raspunda rapid in timp

·        sa fie rezistente la desprindere, desorbtie

Imobilizarea unei enzime determina modificari în parametrii reactiei catalizate de aceasta. Astfel apar modificari semnificative ale vitezei maxime de reactie, a constantei Michaelis-Menten, a temperaturii optime, a pH-ului optim, si a efectului inhibitorilor reactiei enzimatice. Gradul si natura acestor modificari nu depind doar de metoda de imobilizare ci si de natura reactiei enzimatice [Preda, 2003].

Utilizarea preparatelor enzimatice imobilizate la transformarea, prin cataliza eterogena, a diferitelor substraturi, este o practica curenta datorita avantajelor pe care le prezinta:

a). permite utilizarea repetata a enzimei (cu aceeasi cantitate de enzima se poate prelucra o cantitate mai mare de substrat)

b). permite lucrul în instalatii semicontinui si continui, micsorand volumul instalatiei, permitând automatizarea proceselor

c). enzima nu se regaseste în produs, se elimina faza de inactivare termica a enzimei

d). transformarea substratului se poate opri la momentul dorit printr-o operatie mecanica

e). se pot deplasa în mod controlat spre anumite valori pH-ul optim si temperatura optima de actiune a enzimei

f). la utilizarea procedeelor continui scade timpul de contact între enzima, substrat si produsi, scazând în acest fel posibilitatea de a se forma produsi secundari nedoriti

Elementele de baza ale unei enzime imobilizate sunt enzima, suportul si modul de interactiune al enzimei cu acesta. Suportul este de regula un polimer hidrofil cu greutate moleculara mare. Acesta are o importanta contributie la performanta enzimei imobilizate [Kennedy, 1987].

Caracteristicile unui bun suport sunt:

Ř      permeabilitate

Ř      domeniu larg de utilizare

Ř      caracter hidrofil

Ř      insolubilitate

Ř      stabilitate chimica, mecanica si termica

Ř      rigiditate mare

Ř      forma fizica potrivita

Ř      rezistenta la atacul microbian

Ř      regenerabilitate

2.1 Metode de imobilizare

 

 

Organization Chart

 

 

 

2.1.1 Procedee fizice de imobilizare

 

2.1.1.1 Adsorbtia pe suporturi solide

Adsorbtia fizica a enzimei pe un polimer fara a se forma legaturi covalente cu acesta este cea mai veche metoda de imobilizare. Este o metoda extrem de usoara: adsorbantul si enzima sunt amestecate un timp, dar randamentul (enzima legata pe unitatea de adsorbant) este mica, iar enzima este partial sau total inactivata .

S-au folosit o varietate larga de substante adsorbante; fortele de legare dintre enyima si suport pot fi ionice, hidrofobe, legaturi de hidrogen, sau legaturi Van der Waals [Kierstan, 1985].

Exista o deficienta majora la aceasta metoda de imobilizare, aceasta consta în faptul ca legaturile dintre enzima si adsorbant sunt slabe si reversibile, deci enzima se poate elibera de pe suport în momente cheie ale reactiei catalizate.

Desorbtia enzimei de pe suport este determinata de o serie de factori cum ar fi fluctuatiile de pH, temperatura sau tarie ionica. Substratul enzimei adesea duce la desorbtia enzimei de pe suportul adsorbant.

Adsorbtia se produce doar superficial, zona interioara a suportului nefiind utilizata. Preparatele enzimatice imobilizate in acest mod au o activitate specifica redusa. Marirea suprafetei specifice prin maruntirea foarte fina a suporturilor duce la obtinerea de preparate enzimatice cu proprietati hidrodinamice slabe, care se colmateaza rapid si nu permit prelucrarea solutiilor concentrate de substrat, cu vâscozitate ridicata [Kennedy, 1987].

Daca materialul suport este incarcat electrostatic, vecinatatea electrica a enzimei se modifica, ducând la modificarea pH-ului optim de actiune. De cele mai multe ori duce la sporirea stabilitatii termice, a stabilitatii la depozitare si la actiunea enzimelor proteolitice.

Capacitatea ridicata de adsorbtie nespecifica a proteinelor de catre celuloza, o problema in cazul folosiri ca suport a acesteia la imobilizarea enzimelor prin legare covalenta, aici devine un mare avantaj. Astfel s-au folosit la adsorbtia enzimelor rasini celulozice schimbatoare de ioni (carboximetilceluloza, DEAE celuloza), cu capacitati mari de adsorbtie (pâna la 15%)

Majoritatea enzimelor având punctul isoelectric în domeniul de pH acid indica o preponderenta în structura lor a gruparilor incarcate negativ; se utilizeaza deci de preferinta anionitii, de cele mai multe ori în forma R-Cl sau mediu tamponat pentru prevenirea denaturarii enzimelor.

Procesul de desorbtie a proteinelor enzime de pe suport permite regenerarea catalizatorului enzimatic. Dupa un anumit timp de exploatare a preparatului imobilizat, activitatea acestuia scade; prin efectuarea unei noi adsorbtii de enzima se reface activitatea initiala. Prin 24324l112y efectuarea de adsorbtii repetate atunci când activitatea scade se poate mentine un preparat timp îndelungat în exploatare fara a se constata modificari ale proprietatilor fizice ale preparatului sau ale capacitatii de cuplare a enzimei.

Pentru a favoriza procesul de cuplare a enzimei de schimbatorul de ioni se utilizeaza un copolimer etilena - anhidrida maleica a carui solutie în acetona se adauga treptat peste preparatul enzimatic brut, la rece, în mediu tamponat.

Reactia care se produce la deschiderea ciclului anhidridei determina formarea unui numar mare de grupari carboxil adiacente legaturii amidice nou formate. Sporirea numarului de grupari incarcate negativ favorizeaza cuplarea cu schimbatorii de ioni.

O sporire a capacitatii de adsorbtie a suporturilor sintetice se realizeaza atunci când polimerul contine grupari functionale carboxil si hidroxil asezate adiacent si capabile sa formeze complecsi chelatici cu metalele. Caractaristicile geometrice ale zonei active se pot modifica prin variatia raportului între componente, in asa fel încât sa se produca impiedicari sterice care sa determine selectivitate a polimerului adsorbant fata de o enzima sau alta [Chibata, 1978].

2.1.1.2 Entrapare si incluziune

Entraparea unei molecule de enzima se poate realiza pe trei cai:

-incluziune in matricea unui polimer

-separarea din volum in microcapsule semipermeabile

-insolubilizare intr-o faza neapoasa distincta

O caracteristica importanta a primelor doua cai de entrapare este ca enzima nu este efectiv legata de nimic, si deci nu apar nici una dintre problemele sterice asociate cu legarea covalenta sau electrostatica a enzimei de un polimer, cum ar fi legarea enzimei in asa fel incat situsul activ este obstructionat de o portiune a matricei polimerului.

In linii mari entraparea enzimelor consta in dizolvarea enzimei intr-o solutie de precursori ai fazei polimerice, urmata de tratarea acestei solutii astfel incat sa se obtina o faza distincta [Kennedy, 1987].

Includerea in structuri macromoleculare

Enzima poate fi inclusa in reteaua formata de legaturile covalente ale unui polimer reticulat. Daca gradul de reticulare este mic, atunci ochiurile retelei sunt mari, iar enzima poate evada din gel fiind antrenata de solutia de substrat. Daca gradul de reticulare este mare, evaziunea enzimei este împiedicata, dar accesul substratului la centrii activi este la rândul sau ingreunat. Trebuie gasit deci raportul intre monomer si agentul de reticulare care sa nu permita pierderea enzimei in mediul de reactie, dar care sa nu limiteze accesibilitatea la centrii activi ai enzimei. Practic procesul este utilizabil doar daca masa moleculara a enzimei este mult mai mare decât a substratului [Zarnea, 1980].

Reteaua tridimensionala a polimerilor reticulati se poate inlocui cu structuri mai simple de geluri insolubile. Pentru aceasta se utilizeaza frecvent gelurile de acrilamida reticulate cu N,N'- metilenbisacrilamida. Solubilitatea in apa a comonomerilor înlatura dezavantajul utilizarii solventilor organici, permite lucrul la pH-ul la care enzima are stabilitate maxima, precum si dispersarea uniforma a moleculelor de enzima în structura gelului, ceea ce determina marirea accesibilitatii la centrii activi si sporirea vitezei de reactie. Acrilamida se utilizeaza ca solutie în apa sau tamponul potrivit de concentratie 40-50%, iar N,N' - metilenbisacrilamida ca solutie 3%. Oxigenul fiind inhibitor de polimerizare se îndeparteaza din sistem fie prin barbotare de gaz inert fie prin efectuarea polimerizarii în vid. Catalizatori de polimerizare sunt de obicei polisulfatii si β-dimetilaminopropionitrilul pentru gelurile cu grad de reticulare scazut, si riboflavina pentru fotopolimerizarea amestecurilor cu continut ridicat de N,N'- metilenbisacrilamida. Se utilizeaza si radiopolimerizarea prin iradiere cu radiatii γ. Reactia de polimerizare fiind exoterma, temperatura mediului de reactie se mentine la valori care sa nu duca la denaturarea termica a enzmei.

S-au utilizat si alti polimeri sintetici pentru imobilizare cum ar fi: N-vinil-pirolidona radiopolimerizata, 2-hidroxietilmetacrilat polimerizat, obtinânduse preparate cu proprietati hidrodinamice deosebite.

Folosirea amidonului ca suport pentru entrapare se bazeaza pe proprietatea acestuia de a gelifia si a retine la solidificare enzime solubile. Preparatele obtinute astfel au proprietati mecanice slabe, pierd cu usurinta enzima prin eluare cu solutia de substrat si nu pot fi utilizate la rece. O oarecare îmbunatatire a proprietatilor mecanice se obtine prin turnarea gelului de amidon înca fluid pe o spuma poliuretanica.

O metoda mai rudimentara implica folosirea triacetatului de celuloza, în matricea neordonata a careia se poate ingloba enzima, obtinânduse preparate enzimatice imobilizate cu activitate relativ scazuta. În acest scop triacetatul de celuloza se dizolva într-un solvent potrivit (dicloretan, cloroform etc.), imiscibil cu apa. În aceasta solutie s adauga solutia apoasa de enzima si glicerina ca plastifiant. Prin coagularea emulsiei obtinute pe o baie de toluen de obtin fire sau granule de preparat imobilizat. Un avantaj al acestei metode este posibilitatea reutilizarii triacetatului de celuloza, prin redizolvare, la atingerea unui anumit grad de inactivare în lucru a enzimei înglobate. Înlocuirea triacetatului de celuloza cu acetati primari si secundari nu determina sporiri semnificative ale activitatii specifice [Chibata, 1978].

Metode mai noi de entrapare folosesc geluri pe baza de substante anorganice, ex. silice [Avnir, 1994, Ferreira, 2003].

Gelurile de silicati sunt sintetizate mai ales din precursori alcoxid tetrafunctionali folosind un acid mineral (HCl) sau o baza (NH3) drept catalizator. La nivelul gruparilor functionale, sunt utilizate 3 reactii pentru a descrie procesul sol-gel [Brinker, 1990, Reetz, 2000, Reetz, 2003]:

hidroliza:

                     Si-OR +H2O  Si-OH + ROH

esterificarea

condensarea alcoolilor

                     Si-OR + HO-Si  Si-O-Si + ROH

alcooliza

condensarea apei

                     Si-OH + HO-Si  Si-O-Si + H2O

hidroliza

unde R este o grupare alchil CxH2x+1.

Reactia de hidroliza înlocuieste gruparea alcoxid (OR) cu grupare hidroxil (OH). Ulterior reactia de condensare implicând gruparile silanol produce leraturi siloxan (Si-O-Si) si alcool (ROH) si apa H2O ca produse secundare. În majoritatea cazurilor, condensarea începe înainte ca hidroliza sa fie completa.

Deoarece apa si alcoxisilanii sunt imiscibili este utilizat un agent de omogenizare, ex. alcool. Totusi gelurile pot fi preparate din amestec apa-alcoxid de siliciu fara adaos de solvent, daca alcoolul rezultat ca produs secundar din reactia de hidroliza este suficient pentru a omogeniza sistemul separat de faza initiala. Alcoolul nu e un simplu solvent, el poate participa în reactia de esterificare sau alcooliza [Brinker, 1990].

Cei mai utilizati tetraalcoxisilani în procesele sol-gel sunt tetraetoxisilan TEOS (Si(OC2H5)4) si tetrametoxisilan TMOS (Si(OCH3)4). Metoda traditionala de preparare a tetraalcoxisilanului cu un alcool; când e utilizat etanol anhidru, rezulta TEOS + HCl ca produs secundar.

         SiCl4 + EtOH  Si(OEt)4 + 4HCl

Pentru a reduce functionalitatea (numarul situsurilor capabile de a forma legaturi Si-O-Si) precursorilor alcoxid e posibila utilizarea precursorilor organotrialcoxisilan sau diorganodialcoxisilan (R´Si(OH)3 sau R´2 Si(OR)2), în care R´ reprezinta un substituent organic nehidrolizabil.

Gelurile de silice pot fi sintetizate si prin folosirea precursorilor oligomeri. Silicatul de etil 40 este o forma comerciala a etoxipolisiloxanului (polisilicatul de etil) care rezulta atunci când etanolul folosit în productia de TEOS contine apa. Apa si acidul clorhidric rezulta din hidroliza partiala si din condensarea tetraetoxisilanului.

Literatura mentioneaza câtiva precursori precum hexametoxi-disiloxanul, octametiletoxitrisiloxanul si un octamer cubic metoxilat (Si8O12)(OCH3)8.


Octamerul a fost preparat folosind urmatoarele reactii:

[Si8O12]H8  +  8 Cl2             [Si8O12]Cl8  +  8 HCl                                        

[Si8O12]Cl8  +  CH3ONO             [Si8O12](OCH3)8  +  8 NOCl                    

Silicatii organici modificati reprezinta sisteme hibride în care sunt combinate câteva tipuri de precursori.

S-a dezvoltat o productie de silicati cu proprietati unice, combinând tetraalcoxisilanii cu alcoxisilani alchil substituiti si cu alcoxisilani organofunctionali:

Si(OR)4  +  R2Si(OR)2  +  YR'Si(OC2H5)3

R este o grupare alchil, R' este o grupare alchilenica, iar Y este o grupare organo-functionala precum -(CH2)3NH2, -(CH2)3NHCO-O-NH2, ­-(CH2)3S(CH2)2CHO. Daca Y este un ligand polimerizabil, de exemplu un epoxid, este posibil sa formeze o retea organica lânga cea anorganica.


În principiu, astfel de sisteme hibride permit un numar nelimitat de modificari structurale si chimice. Alegerea precursorilor specifici poate fi facuta pe baza solubilitatii sau a stabilitatii termice a substituentilor organofunctionali [Brinker, 1990].

Avantajele oferite de gelurile de silice în imobilizarea enzimelor:

§      rezistenta mecanica îmbunatatita

§      stabilitate chimica si termica mare

§      nu-si modifica volumul în apa sau solventi organici (previne craparea biomoleculelor entrapate)

§      nu sunt surse nutritive pentru microorganisme

§      nu sunt toxice

§      inerte biologic

§      pot fi controlate: aria  suprafetei, dispozitia si dimensiunea medie a porilor

§      nu se fotodegradeaza

§      nu se degradeaza electrochimic

§      pot fi transparente (favorizeaza aplicatiile optice)

§      permit controlul conductivitatii prin intermediul metalalcoxizilor

§      sporesc stabilitatea moleculelor încapsulate datorita rigiditatii cavitatilor formate

§      previn pierderea proteinelor

§      sunt usor de obtinut în forme variate: monoliti, filme subtiri, fibre, prafuri etc.

§      pot fi miniaturizate (dimensiuni de câtiva microni)

§      pot fi atasate altor materiale (plastic, hârtie, metale etc.)

§      ofera reactii de înalta senzitivitate

§      împiedica autodigestia enzimatica



§      ofera un bun potential pentru adsorbtia la suprafata sau pentru legarea covalenta

Pe de alta parte trebuiesc mentionate si dezavantajele  tehnicii sol-gel :

Ř   reteaua de pori îngusti impune limitarea gradului de interactii chimice

Ř   dimesiunile porilor nu permit înca interactiunea cu substrate biopolimerice mari

Ř   enzimele sunt strâns încapsulate

Ř   costurile ridicate ale majoritatii precursorilor alcoxidici

Ř   timp de procesare relativ lung

Ř   volum relativ mare de produse secundare volatile

Ř   dificultatea obtinerii unor produse nefisurate datorita tensiunile interioare dezvoltate în timpul procesarii

Tabel .1

Enzime pure entrapate în sol-gel

          Enzima

Matrice/monomer a

            Observatii

Fosfataza  acida

SiO2/TMOS

Fosfataza  alcalina

SiO2/TMOS

L-aminoacid  oxidaza

Celuloza-TiO2/TiiPr

În fibre

L-aminoacid  oxidaza

SiO2/TMOS

Aspartaza

SiO2/TMOS

Înalt activa

Anhidraza  carbonica

SiO2/TMOS

Catalaza

Coimobilizata cu glucozoxidaza

Chitinaza

SiO2/TMOS

Cu-Zn  superoxid  dismutaza

SiO2/TMOS

Cyanide detector

Citocrom c

ZrO2 -celuloza/Zr(Bu)4

Fibre hibride

Citocrom c

SiO2/TMOS

Detector redox

Citocrom c peroxidaza

SiO2/TMOS

Detector redox

Glucozoxidaza

SiO2/TMOS

Coimobilizare cu peroxidaza pentru detectia de glucoza prin formarea colorantului

Glucozoxidaza

SiO2/TMOS

Detector optic de glucoza reversibil

Glucozoxidaza

V2O5

Detectie electrochimica a H2O2; electrod învelit cu film

Glucozoxidaza

SiO2 - carbon/TMOS

Detector electrochimic (H2O2 sau ferocen)

Glucozoxidaza

SiO2/TMOS

Detectie electrochimica prin  ferocen

Glucozoxidaza

SiO2/TEOS

Detectie electrochimica a O2

Glucozoxidaza

TiO2 -celuloza/TiiPr

Detectie electrochimica; fibre hibride

Glucozoxidaza

ZrO2 -celuloza/Zr(Bu)4

Fibre

β-Glucozoxidaza

SiO2/TMOS

Hidrogen  peroxidaza

Vezi  14

Hidrogen  peroxidaza

V2O5

Detectie electrochimica

Monoamin  oxidaza

SiO2/TMOS

Nitrat  reductaza

SiO2/TMOS

Oxalat  oxidaza

SiO2/TMOS

Coimobilizata cu peroxidaza

Parathion  hidrolaza

SiO2/TMOS

Ureaza

Celuloza-TiO2/TiiPr

Stabila câteva saptamâni

   a TMOS: tetrametoxisilan; TEOS:tetraetoxisilan; TiiPr :titanium triisopropoxid; Zr(Bu)4 : zirconium tetra-n-butoxid

Oricum trebuie mentionat ca toate aceste dezavantaje sunt probleme de moment a caror rezolvare se cauta de catre echipe de cercetatori din lumea întrega.

Procesul sol-gel prezinta interes pentru diferite aplicatii în biotehnologii, medicina, protectia mediului înconjurator, biosenzori si aparate fotonice [Park, 2002].

O mare varietate de biomolecule: proteine, enzime, anticorpi si chiar celule întregi au fost imobilizate în sol-gel (tabelul 1). Ele îsi pastreaza bioactivitatea si ramân accesibile reactivilor externi ce pot patrunde prin difuziune prin silicea poroasa. Sol-gelul poate fi turnat în diverse forme si este transparent, asa ca este posibila asocierea fenomenelor optice si bioactivitatilor pentru aparate fotonice si biosenzori. Specificitatea înalta si sensibilitatea enzimelor si anticorpilor permit detectarea urmelor de substante chimice. Celule vii imobilizate pot fi folosite pentru producerea de metaboliti, aplicatii medicale si protectia mediului înconjurator [Gill, 2000, Jin, 2002, Livage, 2001].

Microencapsularea enzimelor

Microencapsularea preparatelor enzimatice presupune includerea enzimelor în microsfere cu pereti permeabili pentru moleculele de substrat si produs, cu masa moleculara mica si impermeabili pentru macromoleculele de enzima [Bickerstaff, 1997].

Microcapsulele se prepara prin:

1. Coacervare: - separarea fazelor în solutia de polimer si formarea unei membrane semipermeabile datorita solubilitatii mai mici a polimerului la suprafata picaturii.

2. Polimerizare interfaciala: - sinteza unui copolimer insolubil în apa la suprafata picaturii. Un comonomer este partial solubil atât în faza apoasa cât si in faza organica, iar al dilea comonomer este solubil numai în faza organica. Proprietatile membranei semipermeabile obtinute depind de coeficientul de partitie al monomerului solubil intre cele doua faze.

Polimeri utilizati in fabricarea microcapsulelor prin coacervare:

·        nitratul de celuloza

·        polistirenul

·        etilceluloza

·        butiro-acetil-celuloza

Obtinerea microcapsulelor prin polimerizare interfaciala se face prin sistemul poliamidic cu 1,6 diaminohexan (hexametilendiamina) si 1,10 clorura de decanoil, în amestec cloroform-ciclohexan, sistem de solventi pentru care coeficientul de partitie al diaminei între faza apoasa si organica este optim. În anumite conditii în locul diaminei se utilizeaza chiar proteina enzimatica, sau o alta proteina.

Microencapsularea se utilizeaza astazi pentru protejarea suplimentara a enzimelor cuplate la un suport. In acest mod se utilizeaza celuloza aminoetilata, poli-p-aminostirenul diazotat, poliacrilamida. Enzima reactioneaza cu suportul activat chimic, iar produsul obtinut se acopera cu o pelicula de alginat de calciu, etil celuloza, carboximetil celuloza, colodiu, poliacetat de vinil, polivilpirolidona, poliacrilamida, nylon, etc [Bickerstaff, 1997].

 

 

 

 

2.1.2 Procedee chimice de imobilizare

 

2.1.2.1 Legarea covalenta




Aceasta metoda este una dintre cele mai folosite metode de imobilizare. Se obtine o enzima imobilizata legata puternic de suportul polimeric. Legarea covalenta a unei enzime la un suport insolubil presupune obtinerea suportului într-o forma activa, urmata de reactia între aceasta forma si enzima [Dima, 1999].

Metoda a aparut in 1949 când Michael si Ewers au fololsit un derivat al carboximetilcelulozei pentru a imobiliza o varietate de proteine. Aplicarea pe enzime a întârziat pâna în 1954, când Grubhofer si Schleith au folosit un derivat diazo al poli-p-aminostiren-ului la imobilizarea pepsinei, amilazei si carboxipeptidazei [Chibata, 1978].

Popularitatea celulozei ca suport este data de avantajele pe care le prezinta aceasta: este puternic hidrofila, disponibilitate mare, potential ridicat pentru varii derivari, si usurinta cu care se pot produce polimeri pe baza de celuloza atât sub forma de pulberi  cât si sub forma de membrane.

Pentru legarea enzimei la suport este indicat ca în loc sa construim un grup reactiv în celuloza (p-aminobenzoil celuloza), sa folosim un ligant chimic între celuloza si enzima. Un astfel de ligant trebuie sa fie mic si, o data ce a reactionat cu celuloza, sa contina o grupare activa care sa lege enzima. O astfel de molecula ligant este triclortriazina care prezinta trei legaturi active C-Cl care reactioneaza una cu celuloza, una cu enzima, iar cea de a treia se poate lega de orice alt compus. Convenientul la triclortriazina este ca natura ionica a complexului suport-enzima depinde de incarcarea ionica a moleculei ligant, care poate fi anionica, cationica, sau neutra în functie de compusul legat la cea de a treia legatura C-Cl activa

O alta molecula ligant folosita este glutaraldehida care prezinta la ambele capete câte o grupare aldehidica, care la valori neutre de pH va reactiona cu grupari libere amino. Astfel un capat al glutaraldehidei va fi legat de suport iar cealalta de enzima [Kennedy, 1987].

Cea mai comuna metoda de activare a celulozei astazi este cea cu bromcian. Înca nu se cunoaste cu exactitate cum reactioneaza cu celuloza, dar se pare ca la valori mari ale pH-ului reactioneaza usor cu gruparile hidroxi ale polizaharidului, iar derivatul va reactiona apoi cu gruparile amino libere de pe enzima în solutii usor alcaline.

Polizaharidele nu sunt suporturi ideale pentru enzime, acestea prezinta doua inconveniente importante:

                   -sunt susceptibile la atacul bacterian

                   -celuloza prezinta un grad ridicat de absorptie nespecifica de proteine

În consecinta dupa procesul de preparare enzima imobilizata trebuie spalata în substante tampon de tarii ionice mari, acest proces putând inactiva enzimele, mai ales daca forma lor activa este dimerica sau polimerica.

Pentru a depasi acest inconvenient s-a cautat un suport polimeric pentru imobilizarea enzimelor care sa fie hidrofil si rezistent la atacul microbian. Astfel au aparut rapoarte în care, pentru imobilizarea enzimelor, s-au folosit ca suport sticla, nailon, variati derivati ai poliacrilamidei. Numerosi copolimeri acrilici se gasesc astazi sub forma comerciala, care includ grupari active ca: diazo, aldehide, carboximetil sau hidrocianat.

Reactiile de cuplare propriu-zise se pot clasifica astfel:

a). enzima se cupleaza direct la un intermediar reactiv stabil ( de exemplu reactiile de tipul (I-CH=O + H2N-E)

b). enzima se cupleaza direct la un intermediar reactiv nestabil, preparat in situ

c).enzima se cupleaza indirect la un compus macromolecular, prin intermediul unui reactiv bifunctional

Principalele grupari din molecula proteinei enzimatice implicate în reactiile de cuplare sunt:

a). grupari amino - reactioneaza preferential cu agenti de acilare sau alchilare, aldehide, izocianati, izotiocianati etc.

b). grupari carboxil

c). grupari sulfhidril - provenite din resturile de cisteina, reactioneaza preferential cu agentii de alchilare

d). grupari hidroxil - provenite din resturile de serina, reactioneaza preferential cu agentii de acilare

e). grupari imidazol - provenite din resturile de histidina si grupari fenolice, provenite din resturile de tirosina, reactioneaza preferential cu sarurile de diazoniu

Reactivitatea suportului este importanta la obtinerea preparatelor enzimatice imobilizate prin faptul ca gruparile cu reactivitate ridicata reactioneaza neselectiv si rapid, putând modifica ireversibil structura centrului activ al enzimei [Bickerstaff, 1997].

O densitate mare în grupari reactive a suportului determina uneori pierderi de activitate fie prin limitarea accesului substratului la centrii activi, fie prin deformarea mecanica a moleculelor proteice. De asemenea, o distanta geometrica redusa între suport si enzima poate determina pierderi de activitate, de aceea se foloseste frecvent ca reactiv bifunctional glutaraldehida si nu glioxalul [Kennedy, 1987].

Suporturile folosite in prepararea enzimelor imobilizate prin legare covalenta se pot clasifica astfel:

1.suporturi anorganice

2.suporturi macromoleculare de sinteza

3.suporturi macromoleculare de origine naturala

Suporturi anorganice

Un procedeu frecvent utilizat la prepararea suporturilor anorganice reactive este silanizarea acestora. Reactivul silanic (ester, halogenura, silanol) se cupleaza, in mediu anhidru, cu gruparile hidroxil ale suportului, prezenta apei determinând o prehidroliza a reactivului silanic, cu formarea de grupari hidroxil libere care se cupleaza la gruparile suportului:

Cuplarea la suportul anorganic se poate realiza prin unul, doua sau trei resturi hidroxil, taria legaturii crescând în aceasta ordine. Impiedicarile sterice si caracterul competitiv al reactiei gruparilor hidroxil limiteaza gradul de cuplare. Suprafata suportului anorganic se acopera cu mai multe straturi silanice, grosimea stratului final fiind determinata de conditiile de reactie (concentratia reactivului silanic, sistemul de solventi pH, temperatura de reactie, timp de reactie, suprafata specifica a particulelor de purtator)

Silanizarea s-a aplicat la majoritatea suporturilor anorganice: sticla poroasa, alumina, silicat de aluminiu, oxid de nichel, cuart, silicat de magneziu, bioxid de titaniu etc. Reactivii accesibili pentru silanizare sunt specificati in tabelul 2 [Bickerstaff, 1997, Kennedy, 1987, Chibata, 1978].

Tabelul 2.

Reactivi de silanizare

Specificare

Formula chimica

1.γ aminopropil trietoxisilan

2.N-β-(aminoetil) γ-aminopropil

    trimetoxisilan

3.β-(clormetil fenil) etil trimetoxisilan

4.γ-clorpropil trietoxisilan

5.γ-cianopropil trietoxisilan

6.γ-glicidoxipropil trimetoxisilan

7.γ mercaptopropil trimetoxisilan

8.γ-metacriloxipropil trimetoxisilan

Treapta de silanizare este esentiala în procesul de imobilizare deoarece suportul trebuie sa contina un numar ridicat de grupari implicate în reactia de cuplare, dar o densitate exagerata a acestora implica pierderi de activitate prin cuplare înghesuita, împiedicari sterice etc.

Derivatii anorganici silanizati constituie materia prima de preparare a intermediarilor reactivi.

·        Utilizând derivati alchil aminosilanici se obtin urmatoarele tipuri de intermediari reactivi:

a). Intermediari cu grupare carbonilica reactiva:

b).intermediari cu grupare carboxilica reactiva:

·        Utilizând derivati silanici carboxilici se obtin urmatoarele tipuri de intermediari reactivi:

a). Intermediari cu grupare de clorura acida:

b). Intermediari derivati de N-hidroxisuccinimida:

c).intermediari derivati de p-nitrofenol:

·        Alti intermediari reactivi obtinuti asemanator:

a). Derivati arilaminici:

b). Derivasi de fenilhidrazina:

c)derivati triazinici:

d)derivati izocianici sau izotiocianici:

e).derivati de bromacetil:

f). Derivati tiolici:

Etapa urmatoare consta în cuplarea intermediarului reactiv cu enzima. Aceasta legare se face preferential la gruparile aminice ale enzimei in medii de reactie diferite astfel:

§         Gruparile carbonil fixeaza gruparile aminice ale enzimei, prin reactii în medii neutre sau slab acide:

 

§         Gruparile esterice sau clorura de acil fixeaza gruparile aminice in medii slab acide, neutre sau slab bazice:

§         Gruparile izocianat sau tioizocianat fixeaza gruparile aminice, formând derivati de uree sau tiouree;

§         Derivatii triazinici de asemenea:

Suporturi macromoleculare de sinteza

Materialul suport ideal de imobilizare a preparatelor enzimatice întruneste o serie de caracteristici: accesibilitate la preturi moderate, rezistenta la degradare microbiana, rezistenta mecanica, reactivitate chimica si posibilitatea utilizarii sale în diferite forme (granule, folii etc.). În practica un asemenea material este imposibil de gasit. Materialul cel mai apropiat de ideal, mai complet si mai corespunzator, s-a dovedit a fi nylonul.

Principalele modalitati de legare a enzimelor la nylon sunt:

·        Cuplarea la gruparile carboxil

·        Cuplarea la gruparile amino

Densitatea gruparilor reactive poate fi sporita fie printr-o prehidroliza in mediu acid, fie prin aminare in solventi organici. Aceste metode însa determina scindari ale macromoleculelor si pot influenta negativ proprietatile functionale ale suportului. Nylonul în schimb poate fi activat, fara scindare, prin alchilare (cu dimetilsulfat, benyensulfonati sau trietiloxoniu tetrafluoroborat). Intermediarul O-alchilat reactioneaza ca atare cu gruparile amino, sau prin intermediul unui reactiv bifunctional.

Alti compusi macromoleculari de sinteza utilizati la prepararea enzimelor imobilizate sunt:

·        Poli-p-aminostirenul - activat prin diazotare, fosgenare sau tiofosgenare:

·        Polipeptide de sinteza insolubile (copolimerizare de α,N-carboxi-p-amino,N-benzil-oxicarbonil-D-1-fenil alanin anhidrida si N-carboxi-1-leucin-anhidrida în dioxan cu trietilamina ca initiator si activare prin diazotare)

·        Copolimeri de acid metacrilic si m-fluoroanilida acidului metacrilic

·        Copolimeri de etilena si anhidrida maleica reticulati cu diamine

·        Polimeri de acrilamida reticulata, activati fie cu aldehida glutarica, fie cu hidrazina si acid azotos [Bickerstaff, 1997, Chibata, 1978]

Suporturi macromoleculare de origine naturala

Colagenul este un suport ideal pentru imobilizarea enzimelor fiind abundent si ieftin, permite efectuarea reactiilor de cuplare în conditii blânde, este hidrofil, si prezinta o densitate ridicata a gruparilor reactive, si se poate modifica chimic pentru obtinerea unei structuri mai rezistente, tratare cu enzime proteolitice pentru reducerea activitatii antigenice, blocarea gruparilor amino sau carboxil libere pentru a modifica încarcarea electrica superficiala.

Legarea enzimelor la suportul de colagen se realizeaza prin amestecarea solutiei apoase de enzima cu o suspensie de colagen urmata de reticularea produsului rezultat cu aldehida glutarica.

Proprietatile preparatelor imobilizate obtinute nu difera decât in mica masura de proprietatile enzimelor libere, deoarece pH-ul din microvecinatatea matricei de colagen este egal cu pH-ul mediului.

Celuloza si derivatii sai, ca suport pentru imobilizarea enzimelor, s-au utilizat datorita accesibilitatii lor, caracterul lor extrem de hidrofil, si densitatii mari de grupari reactive.

Derivati ai celulozei utilizati la preparatele imobilizate:

1. prin tratarea celulozei cu acid α-cloracetic în mediu alcalin se obtine carboximetilceluloza; esterul ei metilic formeaza hidrazida care prin tratare cu acid azotos formeaza derivatil azidic reactiv:

2. aminoarilderivatii de celuloza, dupa activare prin diazotare:

Celuloza se poate activa direct prin reactia cu clorura de cianuril sau diclorderivatii acesteia. Derivatul rezultat reactioneaza cu gruparile ε amino ale resturilor de lisina:

Prin reactia celulozei, sau a derivatilor acesteia, cu cloroformiatii de alil sau alchil se formeaza carbonati de celuloza care reactioneaza cu enzimele formând preparate imobilizate:

Analog se formeaza si reactioneaza derivatii de bromacetil celuloza:

 

3. Amidonul prezinta avantajul accesibilitati la un pret scazut. Principalul dezavantaj al preparatelor enzimatice este determinata de comportarea hidrodinamica slaba.

Antranilatii de amidon obtinuti prin tratarea amidonului cu anhidrida isatonica si carbonat de sodiu, devin suporturi reactive dupa diazotare

Derivatii dialdehidici ai amidonului, obtinuti prin procedee oxidative se condenseaza cu metilendianilina formând un polimer reticulat. Acesta se reduce cu hidrura de litiu-aluminiu, borohidrura de sodiu etc., si se diazoteaza. Sarea de polidiazoniu formata se cupleaza cu enzima formând preparate imobilizate [Bickerstaff, 1997, Chibata, 1978, Kennedy, 1987, Zarnea, 1980].

2.1.2.2 Copolimerizarea

Desi aceste matrici pot contine doar enzime, este indicata copolimerizarea acestora cu o proteina inerta (albumina) pentru a creste volumul preparatului enzimatic.

Cel mai des folosit compus este glutaraldehida (figura 1). Aceasta are ca efect gelificarea proteinelor, astfel ca este extrem de dificil sa precipitam o matrice de enzima din solutie cu glutaraldehida, deoarece solutia se gelifica.

Pentru a obtine o matrice de enzima si glutaraldehida e necesar ori sa polimerizam glutaraldehida ori sa precipitam enzima (sau sa o adsorbim pe o suprafata insolubila). Acest lucru are ca efect ori cresterea lungimi moleculei de legare ori scaderea distantei intermoleculare dintre enzime.

Cu glutaraldehida se pot obtine foite membranoase de enzime polimerizate cu dimensiunea porilor controlata. Intai se adsoarbe enzima pe o membrana preformata de nitrat de celuloza, apoi se introduce glutaraldehida pentru a lega moleculele de enzima plasate in jurul fibrelor de celuloza. Celuloza este apoi dizolvata cu metanol ramanand o membrana enzimatica.

Desi s-au folosit mai multi compusi multifunctionali (acid N,N'-bisdiazobenzidin-2,2'-disulfonic sau 2,4-dinitro-3,5-difluorobenzen) (figura 1), numai glutaraldehida se foloseste extensiv deoareca reactioneaza rapid cu proteinele in conditii blande; 2,4-dinitro-3,5-difluorobenzenul necesita solutii puternic alcaline si prezenta unui solvent organic, iar acidul N,N'-bisdiazobenzidin-2,2'-disulfonic este un carcinogen exploziv.

Problema majora a acestei metode consta în faptul ca reactantii bifunctionali pot ataca preferential situsul activ al enzimei inactivând-o pe aceasta. Acest inconvenient se poate rezolva prin blocarea reversibila a situsului activ al enzimei cu un inhibitor competitiv [Bickerstaff, 1997, Chibata, 1978].

 

2.2.Alegerea metodei de imobilizare

 

Alegerea metodei de imobilizare este conditionata de o serie de factori care pot limita variantele de procedee aplicabile. Astfel la alegerea unei tehnici de imobilizare ar trebui, pe cat posibil, sa se ia in considerare urmatorii factori:

1. enzima trebuie sa fie stabila in conditiile de reactie

2. daca este posibil gruparile reactive ale suportului sau ale intermediarilor reactivi sa reactioneze preferential cu grupari reactive ale enzimei altele decat cele din situsul activ

3. daca conditia de mai sus nu poate fi satisfacuta atunci reactantul de legare al enzimei trebuie sa fie cat mai mare pentru a nu penetra situsul activ al enzimei. In aceste conditii un polimer activat cum ar fi celuloza este de preferat unui reactiv bifunctional cu molecula mica cum este glutaraldehida.

4. unde este fezabil, situsul activ al enzimei trebuie protejat. Acest lucru se poate obtine, pentru unele enzime, prin incorporarea in amestecul de reactie a unei concentratii de saturatie de substrat, sau cupland la suportul reactiv complexul reversibil enzima-inhibitor. Unele enzime, de exemplu papaina, se pot imobiliza in stare inactiva. O alta posibilitate de protejare a situsului activ presupune modificarea enzimei inainte de cuplare prin introducere de grupari reactive departate de centrii activi.



5. procesul de spalare folosit pentru a indeparta moleculele enzimatice libere, nelegate de suport, nu trebuie sa afecteze enzima. Polimerii celulozici vor adsorbii puternic enzimele, astfel incat va fi necesara folosirea unor solutii de tarii ionice mari la spalare, astfel ca folosirea celulozei ca suport pentru enzime polimerice nu este indicata deoarece procesul de spalare poate provoca disocierea acestor enzime.

6. pentru enzimele imobilizate ce vor fi folosite la catalizarea unor reactii chimice in sistem extensiv se va lua in considerare natura reactiei pe care o vor cataliza inainte de a alege o metoda de imobilizare. Astfel pentru o reactie de hidroliza a unui polimer cu greutate moleculara mare, cum ar fi un polizaharid, nu vom alege o entrapare fizica intro matrice de gel. De asemenea nu vom folosi un polianion drept suport pentru o enzima ce va cataliza conversia unui substrat anionic intr-un produs cationic, mai ales daca enzima este sensibila la inhibitia prin produs de reactie.

7. proprietatile mecanice, in special stabilitatea mecanica si forma fizica, a suportului trebuie luata in calcul. Astfel daca preparatul enzimatic imobilizat trebuie sa apara sub forma de membrana, este de la sine inteles ca trebuie sa alegem un suport care sa poata fi, la randul lui, format sub forma de membrana.

Gasirea unei metode de imobilizare care sa satisfaca toate aceste conditii este foarte rara, astfel ca trebuie ajuns la un compromis care sa satisfaca majoritatea acestor factori limitativi [Kennedy, 1987, Zarnea, 1980].

2.3. Efectul imobilizarii asupra activitatii enzimei

Caracteristicile de reactivitate ale preparatului enzimatic imobilizat sunt influentate de:

1.Suport prin:

§         zona proceselor de difuziune din imediata vecinatate a particulei de enzima

§         modificarea de natura sterica a accesibilitatii substratului la centrii activi

§         geometria moleculara a suportului

§         flexibilitatea structurii suportului

§         -caracterul sau hidrofil, si deci penetrabilitatea de catre solutiile de

§         substrat

§         -interactiunile electrostatice cu substratul

2.Enzima prin:

§         -modificari conformationale suferite de proteina enzimatica in procesul de imobilizare

§         -modificarea chimica a resturilor de aminoacizi implicate in procesul de cuplare

In procesul de imobilizare o parte din activitatea enzimatica se pierde. Bilantul de activitate devine:

A0 = A1 + A2 +A3

Unde:   A0 este activitatea enzimatica initiala, g  enzima x U/g

 A1 este activitatea enzimatica regasita in preparatul imobilizat, g preparat x U/g  

             A2 este activitatea enzimatica regasita in mediul de cuplare, solutii de spalare etc.

             A3 este activitatea enzimatica pierduta in procesul de imobilizare

Pierderile de activitate pot fi datorate:

·                    -participarii la reactia de cuplare a unor resturi de aminoacizi implicate în procesul catalitic

·                    -impiedicarii sterice a accesului substratului la centrii activi

·                    -modificarile produse in conformatia proteinei enzimatice

·                    -limitarile difuzionale intervenite in fenomenele de transport

Randamentele de retinere a activitatii enzimatice în procesul de imobilizare se definesc prin formulele:

-randament de imobilizare (η1)

η1(%) = 100 × A1/A0

-randament de mentinere a activitatii (η2)

η2(%) = 100 × A1 + A2/A0

La cresterea cantitatii de proteina cuplata peste o limita specifica suportului, activitatea enzimatica din preparatul imobilizat (A1) începe sa scada. Scaderea randamentelor de imobilizare odata cu aglomerarea cu proteina a suportului se explica fie prin modificari ale structurii proteice induse de procesul de cuplare, fie prin împiedicarile stericea accesului substratului la toti centrii activi disponibili..

O alta variatie a activitatii enzimelor imobilizate este dependenta de granulometria lor, fiind adeseori invers proportionala cu diametrul mediu al particulelor, mai ales în cazul materialelor suport cu hidrofilicitate medie sau redusa.

Masa moleculara a substratelor influenteaza deasemenea activitatea specifica a preparatelor imobilizate, accesul lor la centrii activi ai catalizatorului fiind limitata de difuziune si împiedicari sterice, activitatea scazând odata cu cresterea masei lor moleculare [Zarnea, 1980, Kennedy, 1987].

2.3.1 Dependenta reactivitatii de pH

Comportarea preparatului imobilizat în comparatie cu enzima solubila în diferite conditii de pH poate fi identica sau diferita in functie de sarcinile electrice ale materialului suport, de modificarile chimice suferite de enzima in procesul de cuplare sau de însasi caracterul electrochimic al reactiei catalizate enzimatic.

Încarcarea electrica a suportului modifica comportarea preparatului enzimatic imobilizat în diferite conditii de pH prin modificarea câmpului electrostatic din microvecinatatea enzimei. Concentratia ionilor de hidrogen este diferita în vecinatatea suportului, cu caracter de polielectrolit, fata de mediul de reactie. Astfel daca materialul suport este incarcat negativ, concentratia ionilor de hidrogen din vecinatatea enzimei este mai mare decat cea din mediul general de reactie, fapt ce determina o crestere a pH-ului optim aparent al enzimei spre valori mai alcaline (fig. 2). Invers daca suportul este incarcat pozitiv, concentratia ionilor de hidrogen din microvecinatatea enzimei va fi mai mica decât cea a mediului global de reactie, si deci valoarea pH-ului optim aparent al enzimei va scadea spre valori mai acide.

Modificarea curbei activitate-pH poate fi datorata si de un gradient de pH determinat de caracterul reactiei enzimatice. Daca in reactia catalizata enzimatic se pun în libertate ioni de hidrogen, pH-ul local scade generând un gradient de pH fata de mediul de reactie. Marimea acestui gradient depinde de activitatea specifica a enzimei si de viteza de difuziune a substratului sau produsului de reactie incarcat electric [Chibata, 1987, Zarnea, 1980, Kennedy, 1987].

2.3.2 Influente difuzionale

Influentele difuzionale sunt determinate de dimensiunea fizica a elementelor implicate în reactiile catalizate de enzime imobilizate (suport si substrat). Este evident faptul ca dimensiunea porilor matricei polimerice, utilizata ca suport la imobilizarea enzimei, influenteaza difuzia substratului pâna la centrii activi, prin blocarea moleculelor de substrat care sunt mai mari în diametru.

Reactivitatea sistemului enzimatic eterogen este influentata de procesele de transport a substratululi din mediu catre enzima imobilizata, si a produsilor de reactie din microvecinatatea enzimei spre mediu.

La primul contact intre enzima imobilizata si substrat acesta difuseaza în interiorul particulei iar enzima începe sa transforme substratul cu o viteza dependenta de concentratia substratului.

Efectele difuzionale se pot imparti în doua tipuri: bariera difuziunala interna si externa

Bariera difuzionala externa este determinata de o zona de solvent neagitata (zona Nernst) în care se stabilesc gradiente de concentratie a substratului si a produsului. Aceste gradiente de concentratie apar datorita vitezei scazute de difuzie a moleculelor in gel si in solutii neagitate si a activitatii catalitice mari a majoritatii enzimelor. În aceasta zona difuzia are loc printr-o combinatie de difuzie moleculara pasiva si convectie. Grosimea zonei Nernst este afectata in anumite limite de viteza de agitare a solventului din vecinatatea enzimei imobilizate, astfel cresterea vitezei de agitare si macinarea la dimensiuni mici a particulelor va duce la subtierea acestei zone.

Bariera difuzionala interna este limitarea difuziei libere în interiorul matricei polimerice determinata de insasi structura matricei. În interiorul suportului polimeric difuzia are loc doar prin difuzie moleculara pasiva si nu este afectata de viteza de agitare a mediului. Bariera difuzionala interna este mai evidenta si mai marcanta in cazul imobilizarii enzimelor prin entrapare in interiorul matricei polimerice decât la imobilizarea prin adsorbtie la suprafata suportului. Astfel se formeaza un gradient de concentratie in interiorul matricei polimerice pâna se ajunge la o stare de echilibru când rata de difuzie a substratului într-un anumit punct din interiorul particulei va fi egala cu rata de transformare a substratului de catre enzima in acelasi punct. Cu cât este mai departat acest punct de suprafata particulei de polimer cu atât scade concentratia de substrat necesara [Chibata, 1987, Zarnea, 1980, Kennedy, 1987].

2.3.3 Modificari conformationale ale enzimei

Abilitatea enzimelor de a actiona ca un catalizator specific depinde de doi factori, si anume, trebuie sa se afle intr-o anumita conformatie si trebuie sa îsi poata schimba aceasta conformatie in timpul catalizei. Primul factor este determinat de specificitatea ridicata de substrat a enzimelor si de faptul ca denaturarea partiala poate dezactiva enzima. Al doilea factor este important in mecanismele de legare specifica a substratului cu formarea complexului enzima-substrat, dupa principiul cheie-broasca, si în modul de actiune al enzimelor alosterice.

 Astfel in cazul legarii covalente de suport, vor aparea modificari conformationale ale enzimei precum si limitari ale capacitatii enzimei de a se

modifica prin faptul ca molecula enzimatica va fi blocata intr-o anumita pozitie, mai ales daca între catalizator si suport exista mai multe puncte de legatura.

Situatia se complica în cazul unei enzime alosterice dimerice unde putem întâlnii o serie de inconveniente determinate de posibilitatea ca enzima sa fie imobilizata prin legarea covalenta doar a uneia dintre cele doua subunitati active:

- subunitatea imobilizata poate fi total inactivata, deci enzima nu se va mai comporta alosteric

- procesele de spalare pot disocia enzima, in care caz va rezulta o enzima monomerica a carei parametri cinetici vor fi diferiti de enzima nativa

- imobilizarea poate sa nu induca modificari conformationale min ambii monomeri dar poate afecta transmiterea modificarilor conformationale de la o subunitate la alta

- imobilizarea poate face neaccesibile situsurile de legare a activatorilor sau inhibitorilor, modificând astfel modul de actiune al enzimelor [Chibata, 1987, Zarnea, 1980, Kennedy, 1987].

2.3.4 Efectul imobilizarii asupra stabilitatii enzimei

Unul dintre scopurile imobilizarii enzimelor este chiar cresterea stabilitatii acestora în conditiile de reactie (fig. 3). S-a demonstrat ca acest fapt se datoreaza in principal urmatoarelor doua motive:

1. imobilizarea proteazelor previne autoliza prin restrictionarea contactului intermolecular

2. fixarea unei enzime într-o matrice polimerica, care nu este afectata de pH sau temperatura, previne acesti factori de mediu limitativi pentru enzima solubila, sa induca modificari conformationale enzimei mobilizate

Experiente recente au demonstrat ca stabilitatea enzimelor solubile nu este dependenta doar de conditiile fizice ale mediului de reactie, ci si de enzima în sine si chiar de concentratia proteinelor. Astfel se explica stabilitatea ridicata a enzimelor imobilizate, care se gasesc concentrate local in mediu, fata de cele solubile, dispersate în întregul volum si, deci în concentratie mica.

Încarcarea mare a suportului cu enzime si limitarile difuzionale ale acestuia fac ca în conditii normale de reactie, doar o fractiune din enzima imobilizata sa vina în contact cu substratul si sa manifeste activitate. Astfel chiar si dupa o dezactivare termica a enzimei imobilizate aceasta înca mai manifesta activitate catalitica o perioada, dupa care aceasta va scadea brusc în momentul în care concentratia enzimei active scade sub nivelul în care difuzia substratului nu mai este un factor limitativ [Chibata, 1987, Zarnea, 1980, Kennedy, 1987].

2.4. Aplicatii ale enzimelor imobilizate

Aplicatiile practice ale enzimelor imobilizate cuprinde un spectru larg de domenii. Aceste domenii pot fi împartite in trei categorii importante:

-         domeniul analitic

-         domeniul terapeutic

-         domeniul industrial

În utilizarea enzimelor imobilizate în aplicatii, trebuiesc luate în considerare trei criterii pertinente:

-         este mai ieftin?

-         este mai eficient?

-         se poate executa procesul prin alt sistem?

Pentru domeniul industrial criteriul limitativ este costul. Pentru celelalte domenii, mai importanta este eficacitatea.

Un aspect al enzimelor imobilizate care le face extrem de practice este posibilitatea automatizarii proceselor care implica utilizarea lor [Chibata, 1987; Zarnea, 1980].

2.4.1. Aplicatii analitice

 

Aplicatiile analitice ale enzimelor pot fi împartite în doua arii: electrozii enzimatici si analizatorii automatici.

Electrozii enzimatici sunt electrozi capabili sa genereze un potential electric ca rezultat al reactiei catalizate de enzima imobilizata pe sau în jurul electrodului.

Primul electrod enzimatic preparat este un electrod sensibil la glucoza. Acesta s-a realizat prin imobilizarea glocozoxidazei intr-un gel de poliacrilamida, fixat apoi în jurul unui electrod de oxigen cu acetat de celuloza. Principiul de functionare este simplu: enzima catalizeaza eliminarea oxigenului din solutie cu o viteza dependenta de concentratia de glucoza.

Aplicatiile enzimelor în autoanaliza implica înlocuirea enzimelor solubile existente într-un sistem de autoanaliza cu acestea. Folosirea enzimelor solubile prezinta inconveniente prin faptul ca în fiecare proba de analizat se adauga câte un solubilizat din enzima libera, acesta pierzându-se. Alternativa este imobilizarea enzimei respective pe peretele unui tub de naylon prin care se trece proba de analizat. Este necesar totusi în acest caz calcularea dimensiunilor tubului în raport cu rata de curgere a probei. Un avantaj al acestui sistem este faptul ca pe aceeasi proba se pot face mai multe determinari [Karube, 1987].

 

2.4.2. Aplicatii terapeutice

Enzimele pot fi utilizate ca agenti terapeutici fie pentru a înlocui enzime proprii ale organismului care lipsesc din cauza unor malformatii genetice sau tisulare, fie ca agenti de degradare specifici ai unor metaboliti nedoriti.

Exista multe boli care sunt datorate absentei unei anumite enzime, de exemplu o malformatie genetica care determina absenta unei enzime lisosomale, substratul acesteia acumulându-se in celula, cu rezultate dezastruoase pentru organism. Functionarea defectuoasa a tesuturilor, în special a rinichiului si ficatului, poate determina acumularea în organism a unor substante toxice, cum este ureea.

Prin injectarea unei enzime solubile de origine microbiana, pentru a acoperii carenta acestor enzime, poate face mai mult rau decât bine, deoarece enzima este ''non-self'' si determina o reactie alergica care poate fi fatala. Un alt inconvenient este instabilitatea enzimei solubile, care va fi rapid dezactivata si eliminata din organism de catre sistemul imun.

Imobilizarea enzimei înainte de administrare rezolva ambele inconveniente prin prevenirea interactiunii dintre enzima si sistemul imun al organismului, precum si prin stabilizarea si protejarea enzimei. Cea mai buna metoda de imobilizare în acest caz este microencapsularea într-un material non-antigenic (nylon, coloidon, etc.).

Desi de cele mai multe ori inlocuirea enzimelor implica reactii simple hidrolitice sau oxidative (ureaza, catalaza etc.), unele deficiente enzimatice implica enzime complexe (dehidrogenaza, kinaza etc.). În acest caz este necesara introducerea în preparatul enzimatic imobilizat, a sistemelor regenerative NAD / NADH sau ADP / ATP deoarece coenzimele în general nu sunt prezente în mediul extracelular.

În terapia enzimatica enzima ce va fi administrata nu se gaseste in conditii normale în organism. Cel mai bun exemplu de terapie enzimatica este tratamentul cu asparaginaza a anumitor forme de leucemie. Celulele normale au capacitatea de a sintetiza asparagina, dar unele celule canceroase nu, acestea bazându-se pe surse externe de asparagina pentru dezvoltare. Prin introducerea asparaginazei în fluxul sanguin, nivelul asparaginei este mentinut la un nivel minim. Asfel celulele canceroase mor ca urmare a lipsei asparaginei. Asparaginaza trebuie imobilizata într-o forma biodegradabila, de exemplu prin incluziune într-un liposom sau capsula de acid polilactic [Karube, 1987].

2.4.3. Aplicatii industriale

 

În aplicatiile industriale, pentru a transforma o substanta organica în produsi de reactie utili exista trei posibilitati:

a). transformari chimice

b). fermentatii cu celule microbiene întregi

c). reactii catalizate enzimatic

Transformarile chimice, desi nelimitate virtual, în practica unele sunt fie prea costisitoare, fie tehnic dificile. De exemplu sinteza chimica a antibioticelor este impracticabila, la fel si extractia chimica a lactozei din lapte.

Fermentatiile celulare au avantajul de a asigura o oarecare specificitate a reactiei, conditii de mediu normale si asigura un randament bun. În schimb apar si unele inconveniente: aparitia produsilor de reactie nedoriti datorita cailor metabolice alternative prezente in celula, este necesara utilizarea unor conditii aseptice riguroase.

Folosirea enzimelor prezinta numeroase beneficii: reactia enzimatica este specifica atât fata de substrat cât si fata de produsul de reactie, contaminarea microbiana are o importanta mai scazuta, nu este necesar folosirea unui mediu nutritiv pentru dezvoltarea microorganismului, nu exista membrana celulara care sa împiedice interactiunea dintre enzima si substrat. Totusi folosirea enzimelor solubile în procese industriale poate ridica anumite probleme: enzima poate fi instabila, nu se poate reutiliza, este greu de automatizat. Unele sau chiar toate aceste inconveniente se pot elimina prin imobilizarea enzimelor [Chibata, 1987]

Separarea DL-aminoacizilor

Aminoacizii pot fi produsi industrial fie prin sinteza chimica fie prin fermentatie. Desi sinteza chimica prezinta avantajul eficientei economice, rezultatul este forma racemica DL-aminoacid, optic inactiv. Pentru a avea valoare acesta trebuie redus la forma activa L.

Dintr-o varietate de metode chimice si biochimice cea mai buna varianta o reprezinta folosirea aminoacilazei imobilizate [Preda, 2003].

DL-aminoacidul obtinut prin sinteza chimica este hidrolizat selectiv de catre aminoacilaza L-specifica din Aspergillus oryzae (E.C. 3.5.1.4.) la formele, L-aminoacid si D-acilaminoacid. Acestea se pot separa usor pe baza solubilitatii lor diferite. D-aciaminoacidul este apoi racemizat la forma DL-aminoacid si reutilizat.

Metoda este utilizata pentru fabricarea unor L-aminoacizi ca L-Met si L-Val.


Procesul Tanabe utilizeaza o coloana împachetata cu aminoacilaza imobilizata DEAE-Shepadex în proces de operare continuu.

Degusa, pe de alta parte, utilizeaza acilaza libera într-un bioreactor membrana. Metoda este atractiva numai pentru L-aminoacizi (nu pentru D-aminoacizi ) si, de aceea se utilizeaza numai pentru producerea acestora. Procesul este eficientizat atât prin utilizarea eficace a enzimei cât si prin racemizarea izomerului nedorit [Chibata, 1987].

Tratarea laptelui

Utilizarea preparatelor enzimatice imobilizate în industria laptelui se împarte în trei directii:

- prepararea brânzeturilor

-stabilizare enzimatica

-extractia lactozei din lapte

Prima faza in procesul de productie al brânzei este coagularea. Traditional aceasta se face adaugând renina izolata din tractul intestinal al vitelului. Renina intestinala însa este scumpa, astfel ca în procesele industriale s-a trecut la utilizarea reninei microbiene. Sunt necesare cantitati însemnate de renina, deci folosirea ei în stare solubila duce la costuri de productie ridicate. Preparatele imobilizate de renina au adus o rezolvare prin folosirea aceleiasi cantitati de enzima la coagularea unei cantitati mai mari de lapte. În plus prin trecerea laptelui în flux continuu peste un strat de enzima imobilizata la o temperatura de 370C, acesta coaguleaza. Astfel procesul de preparare a brânzei poate deveni un proces continuu.

Zerul rezultat ca subprodus al industriei brânzeturilor, contine o proteina, saruri, si mari cantitati de lactoza. Hidrolizatele de lactoza, glucoza si galactoza, pot fi utilizate la fabricarea îndulcitorilor sintetici. Astfel cu ajutorul lactazei imobilizate se poate automatiza procesul de hidroliza a lactozei din zer cu obzinere de glucoza si galactoza.

Tratarea laptelui cu tripsina imobilizata a determinat o crestere a stabilitatii în timp a laptelui cu 2-3 saptamâni fara a se constata oxidari sau schimbarea gustului [Ullmann's Enciclopedia of Industrial Chemistry, 1987; Peppler, 1987].












Document Info


Accesari: 11669
Apreciat:

Comenteaza documentul:

Nu esti inregistrat
Trebuie sa fii utilizator inregistrat pentru a putea comenta


Creaza cont nou

A fost util?

Daca documentul a fost util si crezi ca merita
sa adaugi un link catre el la tine in site

Copiaza codul
in pagina web a site-ului tau.




Coduri - Postale, caen, cor

Politica de confidentialitate

Copyright © Contact (SCRIGROUP Int. 2019 )