Enzimele proteolitice ale tractului gastro-intestinal
Aceste enzime sunt secretate de catre pancreas si glandele din mucoasa tubului digestiv alaturi de enzimele ce participa la digestia celorlalte componente ale bolului alimentar. La nivelul stomacului sunt secretate pepsina, gastricsina si renina, pancreasul sintetizeaza si secreta tripsina, chimotripsina si carboxipeptidazele, iar sucul intestinal contine enteropeptidaza, aminopeptidaze, tripeptidaze, dipeptidaze si carboxipeptidaze. Unele enzime sunt secretate sub forma zimogenilor lor inactiv 636c29g i. Acestia sunt convertiti īn enzime active prin scindarea hidrolitica a anumitor legaturi peptidice cu īndepartarea unor fragmente oligopeptidice.
Pepsina (E.C. - 3.4.4.1.) este raspāndita īn sucul gastric al tuturor vertebratelor. Pepsinele izolate din diferite surse se deosebesc īntre ele prin unele proprietati cum ar fi stabilitatea, structura primara, specificitatea de substrat etc. Dat fiind faptul ca īn conditii fiziologic normale pH-ul sucului gastric se situeaza īn zona puternic acida (1,0 - 2,0), pepsina poseda o stabilitatea foarte mare īn mediu puternic acid. Ea este activa īn intervalul de pH 1,0 - 4,0 cu un pH optim de actiune de 1,8, iar la pH = 5,0 se denatureaza.
Pepsina este sintetizata sub forma zimogenului sau inactiv numit pepsinogen. Conversia acestuia īn pepsina activa are loc la pH acid, sub influenta protonilor dupa care continua autocatalitic īn sensul ca pepsina formata catalizeaza conversia īn continuare a pepsinogenului īn enzima activa. Activarea pepsinogenului consta īn clivarea hidrolitica a unor fragmente oligopeptidice de la capatul N-terminal ceea ce face sa existe o diferenta relativ mare īntre masa moleculara a zimogenului (42.000 Da) si cea a enzimei active (34.500 Da). Procesul de activare a pepsinogenului este deci o reactie de proteoliza limitata.
Īn acest proces de activare, din molecula pepsinogenului este īndepartata o peptida cu masa moleculara de 3.100 Da care reprezinta inhibitorul pepsinei si alte 5 oligopeptide diferite cu masele moleculare de aproximativ 1.000 Da. Cu toate acestea, mecanismul complet al activarii pepsinogenului nu este īnca pe deplin elucidat.
Atāt molecula pepsinei cāt si cea a pepsinogenului contin cāte un singur capat N-terminal si respectiv C-terminal ceea ce demonstreaza faptul ca acestea sunt formate din cāte un singur lant polipeptidic. La capatul N-terminal al moleculei pepsinogenului se afla un rest de lizina, iar īn molecula pepsinei un rest de izoleucina īn timp ce la capatul C-terminal al ambelor forme se gaseste cāte un rest de alanina. Atāt pepsina cāt si pepsinogenul contin īn molecula cāte 3 punti disulfidice intracatenare.
Pepsina prezinta o mare afinitate pentru aminoacizii aromatici. De aceea ea hidrolizeaza īn proteine acele legaturi peptidice la formarea carora participa gruparile aminice ale fenilalaninei si tirozinei cu formarea unor peptide ale caror mase moleculare oscileaza īntre 600 si 3.000 Da. Pepsina nu hidrolizeaza īnsa keratinele, fibroina, ovomucoidul si are o actiune limitata asupra protaminelor si a proteinelor din oase si cartilaje.
Gastricsina (E.C. - 3.4.4.22) este o enzima proteolitica ce a fost evidentiata īn sucul gastric la om, porc si cāine. Spre deosebire de pepsina, gastricsina are un pH optim de actiune ceva mai crescut (3,2 fata de 1,8). Ea se mai deosebeste de pepsina prin mobilitatea sa electroforetica, termostabilitate si specificitate de substrat.
Renina (E.C. - 3.4.4.3.) se īntālneste īn stomacul rumegatoarelor si, probabil, copiilor sugari. Cea mai bine studiata este renina din stomacul viteilor cunoscuta sub numele uzual de cheag. Aceasta enzima a fost folosita din cele mai vechi timpuri la fabricarea brānzeturilor sub forma de extract de cheag. Renina mai este cunoscuta si sub alte denumiri: ferment de cheag, labferment, chimaza, chimozina etc. pH-ul optim de actiune al reninei se situeaza īn jurul valorii de 3,5, iar din punctul de vedere al specificitatii de substrat renina se asemana cu pepsina. Aceasta enzima se sintetizeaza īn mucoasa gastrica sub forma zimogenului sau numit prorenina, iar mecanismul conversiei īn renina activa este asemanator cu cel al activarii pepsinogenului.
Enzimele proteolitice sintetizate īn pancreas se formeaza tot sub forma precursorilor lor inactivi, locul biosintezei reprezentāndu-l reticulul endoplasmatic al celulelor acinare ale acestei glande cu functiune mixta.
Tripsina (E.C. - 3.4.4.4.) este sintetizata si secretata de catre pancreasul exocrin sub forma zimogenului sau - tripsinogen. Conversia acestuia īn enzima activa este initiata de enterokinaza (enteropeptidaza), enzima secretata īn sucul intestinal dupa care procesul continua autocatalitic īn sensul ca primele molecule de tripsina formate catalizeaza transformarea a noi molecule de tripsinogen.
Procesul de conversie a tripsinogenului īn tripsina activa consta īn scindarea hidrolitica a legaturii peptidice Lys6 - Ile7 din molecula zimogenului cu eliberarea hexapeptidei Val - (Asp)4 - Lys situata la extremitatea N-terminala a catenei polipeptidice. Aceasta reactie este activata de ionii de calciu.
Tripsinele izolate din surse diferite au o structura primara asemanatoare dar nu identice. Astfel, tripsinele de om si curcan contin cāte patru punti disulfidice, iar cele izolate din intestinul de bou, porc si oaie contin sase asemenea legaturi. Spre deosebire de tripsinele de la mamifere, tripsina de curcan are un continut foarte scazut īn lizina.
Activitatea maxima a tripsinei se manifesta la pH cuprins īntre 7,0 si 9,0 enzima hidrolizānd preponderent legaturile peptidice la formarea carora participa grupele -COOH ale lizinei si argininei. La nivelul intestinului subtire unde se varsa sucul pancreatic, tripsina hidrolizeaza aceste legaturi īn polipeptidele rezultate īn urma actiunii pepsinei la nivel gastric. Mecanismul de actiune al tripsinei a fost descifrat prin utilizarea unor substrate sintetice cum ar fi etil-benzoil-lizina si etil-N-acetilglicocolul.
Fig. 10. Interactiunea centrului activ al tripsinei cu esterul etilic al L-benzoil-L-lizinei (stānga ) si respectiv esterul etilic al N-acetil-glicinei īn prezenta propilaminei (dreapta) (I.F.Dumitru - 1980)
Chimotripsina (E.C. - 3.4.4.5.) este sintetizata si secretata de catre pancreasul exocrin de asemenea sub forma precursorului sau inactiv numit chimotripsinogen. Conversia zimogenului īn chimotripsina activa este catalizata de tripsina sau decurge autocatalitic. Īn realitate exista doua enzime care se deosebesc īntre ele dupa punctul lor izoelectric: chimotripsina A cu pHi = 9,1 si chimotripsina B cu pHi = 5,2.
Conversia chimotripsinogenului A īn enzima activa este un proces complex ce determina aparitia a cinci chimotripsine.La bovine, īn procesul de activare a chimotripsinogenului A se scindeaza hidrolitic legatura peptidica Arg15 - Ile16 din molecula zimogenului cu formarea chimotripsinei, aceasta reprezentānd primul produs al actiunii tripsinei. Īn continuare, īn molecula chimotripsinei se scindeaza autocatalitic legatura peptidica Leu13 - Ser14 cānd se formeaza chimotripsina si se elibereaza dipeptida seril-arginina ce corespunde resturilor de aminoacizi din pozitiile 14 si 15 ale moleculei zimogenului.
Din chimotripsina se elibereaza dipeptida treonil-asparagina si se formeaza chimotripsina īn urma hidrolizei autocatalitice a legaturilor peptidice din pozitiile 146 - 147 si respectiv 148 - 149. Chimotripsinele contin īn moleculele lor cāte doua catene polipeptidice ,īn timp ce molecula chimotripsinei contine trei asemenea catene notate cu A, B si C unite īntre ele prin punti disulfidice. Chimotripsinele sunt mai putin studiate si probabil ca ele sunt asemanatoare cu chimotripsina. Īn prezent se considera chimotripsinele ar putea reprezenta forme cristaline diferite ale uneia si aceleiasi proteine, aceste forme putānd sa apara īn functie de valoarea de pH la care se face cristalizarea.
Prin activarea chimotripsinogenului B sub actiunea catalitica a tripsinei se formeaza chimotripsina B care este identica cu -chimotripsina din punctul de vedere al specificitatii de substrat.
Specificitatea de substrat a chimotripsinei este relativ larga, enzima putānd hidroliza legaturile peptidice realizate de diferiti aminoacizi. Activitatea cea mai mare īnsa, atāt īn cazul substratelor proteice cāt si al substratelor sintetice, se īnregistreaza asupra legaturilor peptidice date de grupele -COOH ale aminoacizilor aromatici (fenilalanina, tirozina, triptofan) si ale leucinei si este mult mai mica īn cazul metioninei.
Cercetari recente au demonstrat faptul ca actiunea hidrolitica a chimotripsinei asupra substratelor are loc cu formarea enzimei acilate īn calitate de produs intermediar.
Centrul activ al chimotripsinei contine resturile His57 si Ser195 care sunt dispuse īn asa fel īncāt nucleul imidazolic este localizat la o distanta mai mica de 4Å de atomul de oxigen al serinei. Atomul N2 al histidinei formeaza o legatura de hidrogen cu hidroxilul serinei, iar a doua legatura de hidrogen ia nastere īntre N4 al restului de histidina si grupa carboxilica a restului Asp102, rest situat īn interiorul moleculei enzimatice.
Se formeaza un sistem de punti de hidrogen ce determina o crestere a sarcinii negative la hidroxilul serinei din care cauza oxigenul acesteia poate ataca cu usurinta carbonul carbonilic al legaturii ce urmeaza a se hidroliza.
Deoarece pepsina, tripsina si chimotripsina scindeaza hidrolitic legaturile peptidice din interiorul catenelor polipeptidice ale proteinelor substrat, ele apartin grupului de enzime numite endopeptidaze, spre deosebire de carboxipeptidaze, aminopeptidaze si dipeptidaze care sunt exopeptidaze deoarece catalizeaza hidroliza resturilor de aminoacizi terminali.
Carboxipeptidazele cu denumirea stiintifica carboxipeptid-aminoacid-hidrolaze, E.C. - 3.4.2.) alcatuiesc un grup de enzime proteolitice care catalizeaza hidroliza resturilor de aminoacizi de la extremitatile C-terminale ale catenelor polipeptidice. Īn sucul pancreatic se īntālnesc zimogenii a doua carboxipeptidaze notate cu A si B. Aceste doua enzime se deosebesc īntre ele īn functie de viteza cu care hidrolizeaza resturile C-terminale ale diferitilor aminoacizi. Astfel, carboxipeptidaza A (E.C. - 3.4.2.1.) are o mare afinitate fata de aminoacizii aromatici si cei alifatici cu catena scurta aflati īn pozitiile C-terminale, īn timp ce carboxipeptidaza B (E.C. - 3.4.2.2.) catalizeaza cu viteza mare hidroliza resturilor C-terminale ale aminoacizilor bazici (lizina si arginina). Datorita īnaltei lor specificitati, ambele enzime se utilizeaza cu succes īn biochimia proteinelor la determinarea structurii primare a acestora, mai exact la determinarea secventelor C-terminale ale proteinelor si peptidelor.
Ca si īn cazul celorlalte enzime proteolitice ale tractului digestiv, carboxipeptidazele sunt sintetizate si deversate īn sucul pancreatic sub forma de procarboxipeptidaze, acesti zimogeni fiind activati īn intestinul subtire sub actiunea hidrolitica a tripsinei.
Carboxipeptidaza A este o metaloenzima ce contine īn molecula sa un atom de zinc īn calitate de grupare prostetica. Prin īndepartarea acestuia sau īnlocuirea lui cu un alt metal, enzima īsi pierde complet capacitatea catalitica. Ionul de zinc este fixat de apoenzima prin legaturi coordinative la nivelul resturilor His69, Glu72 si respectiv His196.
Carboxipeptidaza B este de asemenea o metaloenzima. Pentru enzima din intestinul de bou si porc s-a stabilit prezenta unui atom de zinc īn molecula care se leaga de apoenzima la nivelul unei grupe sulfhidril a unui rest de cisteina.
Īn sucul intestinal se gasesc, de asemenea, o serie de enzime proteolitice care īndeplinesc un rol bine determinat atāt īn digestia propriu-zisa a proteinelor cāt si īn activarea zimogenilor celorlalte proteinaze.
Enteropeptidaza sau enterokinaza (E.C. - 3.4.4.8.) este o enzima proteolitica a carei functie biochimica principala consta īn declansarea procesului de conversie a tripsinogenului īn tripsina activa.
Aminopeptidazele (-aminopeptid-aminoacid-hidrolaze, E.C. - 3.4.1.) sunt peptid-hidrolaze care scindeaza resturile aminoacizilor localizati la extremitatile N-terminale ale peptidelor si proteinelor substrat. Exista mai multe aminopeptidaze ce se deosebesc īntre ele īn primul rānd īn functie de specificitatea de substrat dar si īn functie de alte proprietati. Dintre acestea, mai bine studiata este leucil-aminopeptidaza (E.C. - 3.4.1.1.) care hidrolizeaza aminoacidul N-terminal atunci cānd acesta este leucina. De foarte mult timp s-a considerat ca aceasta este o metalo-enzima dar, abia īn 1969 s-a demonstrat ca molecula leucil-aminopeptidazei contine un atom de zinc si ca īndepartarea acestuia sau īnlocuirea lui cu un atom de cadmiu conduce la pierderea completa a capacitatii catalitice. Aceasta enzima este activa īn mediu slab alcalin, pH-ul sau optim de actiune situāndu-se īntre 8,0 si 9,0.
Aminotripeptidaza (aminoacil-dipeptid-hidrolaza, E.C. - 3.4.1.3.) este raspāndita nu numai īn intestin ci si īn piele, sānge, plamāni, muschi si alte organe si tesuturi. Aceasta enzima actioneaza asupra tripeptidelor ce contin īn molecula resturi de aminoacizi neutri, hidrolizānd aminoacidul ce ocupa pozitia N-terminala.
Dipeptidazele (dipeptid-hidrolazele, E.C. - 3.4.3.) sunt enzime ce hidrolizeaza dipeptidele cu formare de aminoacizi liberi. Rolul biochimic al acestora consta īn faptul ca ele desavārsesc procesul de digestie a proteinelor ocupānd deci o pozitie terminala īn succesiunea reactiilor hidrolitice prin care proteinele alimentare sunt convertite īn aminoacizi liberi. Dipeptidazele prezinta o īnalta specificitate de substrat, cele mai bine studiate fiind urmatoarele:
- glicil-glicin-dipeptidaza prezinta o actiune specifica asupra dipeptidei glicil-glicina;
- L-leucin-hidrolaza scindeaza hidrolitic glicil-leucina;
- imino-dipeptidaza, cunoscuta si sub denumirea de prolinaza, actioneaza asupra diferitelor dipeptide īn care pozitia N-terminala este ocupata de prolina sau hidroxiprolina;
- imido-dipeptidaza sau prolidaza este singura enzima proteolitica ce poate hidroliza legaturile peptidice al caror atom de azot nu este legat de hidrogen.
|
