EFECTUL AGONISTILOR SI ANTAGONISTILOR ALFA SI BETA ADRENERGICI ASUPRA ANHIDRAZEI CARBONICE - STUDII IN VIVO

EFECTUL AGONIsTILOR sI ANTAGONIsTILOR ALFA sI BETA ADRENERGICI ASUPRA ANHIDRAZEI CARBONICE - STUDII IN VIVO

Introducere

Anhidraza carbonica a fost descoperita în 1932 de catre Meldrum si Roughton. Aceasta enzima catalizeaza una dintre cele mai simple reactii, cea dintre CO₂ si apa. Pâna nu de mult, rolul anhidrazei carbonice a fost redus doar la acela de catalizator al acestei reactii. Nu s-a tinut însa seama de variatiile importante ale ph-ului pe care aceasta reactie le determina în organism, si nici de implicatiile fiziologie si fiziopatologice ale acestei variatii de ph.(1)

În aceasta lucrare vom abrevia anhidraza carbonica cu urmatoarea abreviere: AC.

Lucrarea de fata îsi propune sa demonstreze prin studii in vivo, ca AC este activata de catre agonistii alfa si beta adrenergici, pe când, antagonistii acestora determina inactivarea AC de catre acestia. În acest scop, aceasta lucrare doreste sa demonstreze ca AC I, care este cuplata cu receptori specifici, moduleaza 424f52e raspunsul vascular la catecolamine modificând ph-ul prin urmatorul mecanism: activarea AC I scade ph-ul intracelular cu scaderea consecutiva a cGMP, cea ce duce la vasoconstrictie si cresterea tensiunii arteriale. Prin acelasi mecanism inhibarea AC I duce la cresterea ph-ului celular, urmata de acumularea de cGMP, de vasodilatatie si scaderea tensiunii arteriale.

Cercetarile recente au dovedit prin metode de biologie moleculara (clonarea ADN-ului) existenta a cel putin 9 tipuri de receptori adrenergici: 2 alfa₁(2), 3 alfa₂ (3), 1 beta₁ (4), 1 beta₂ (5), 1 beta₃ (5), 1 beta avian(6).

Toti acesti receptori sunt asociati cu proteinele G. Receptorii adrenergici activeaza proteina G_s si cresc activiatea adenilat ciclazei si productia de cAMP de 7-10 ori iar a cGMP de 2-4 ori. (7) Receptrii alfa₁ activeaza fosfolipaza C si calciul. Receptorii alfa₂ inhiba adenilat ciclaza prin proteina G_i, dar activeaza fosfolipaza C, având un mecanism dual. (8) Activitatea asociata beta si alfa₁ creste de 100 de ori concenctratia de cAMP si cGMP intracelular. (9) Acumularea de cAMP este dependenta de ph-ul intracelular.(9) Astfel cresterea ph-ului intracelular creste acumularea de cAMP si cGMP, iar scaderea ph-ului duce mai ales la scaderea cGMP.

Material si metoda

Am urmarit efectul produs asupra activitatii AC din hematiile umane de catre agonistii si antagonistii alfa si beta adrenergici. Dintre agonisti am utilizat noradrenalina (predomina efectul alfa₁ agonist), si orciprenalina (beta agonist, dar predomina efectul beta₂ agonist). Dintre antagonisti am folosit propranolol, (beta blocant neselectiv).

Determinarile s-au efectuat dupa metoda stoped flow.

Principiul reactiei are ca punct de plecare metoda de determinare colorimetrica a modificarilor de ph. Este masurat timpul în care ph-ul amestecului de reactanti scade de la valoarea initiala la valoarea finala. (10) Urmarirea reactie se face spectrofotometric utilizând indicatori de culoare care vireaza în domeniul de ph ales.

Aparatura S-a folosit spectrofotometru Hi-Tech SF 51 MX (Hi- Tech, Anglia). Acetsa este prevazut cu u nitatea de amestec si cu un sistem de patru seringi pentru introducerea reactivilor. Semnalul transmis prin fotomultiplicator de la camera de amestecare este preluat de un acalculator compatibil prevazut cu interfata Omega DAS-50 (Anglia) si cu faculitati de prelucare matematica a datelor, prin programul RKBIN IS-1 (Hi- Tech, Anglia). Alimentarea reactivilor în cuva de reactie se face pe doua cai separate: o seringa realizeaza introducerea amestecului de reactie compus dins eringa tampon, iar cea de a doua seringa realizeaza introducerea substratului. Fluxul de reactivi se amesteca la intrarea în cuva, moment în care se decsanseaza reactia propriu zisa si începe monitorizarea ei.

Reactivi:

Indicator de culoare: p-nitrofenol (pKa 7.1) în concentratie de 0.2 mM, care prezinta un peak maxim de absorbtie la 400nm. De aceea am efectuat toate masuratorile la 40 nm, urmarind descresterea în absorbanta a maximului de absorbtie, corespunzator cu modificarea culorii indicatorului de la galben (ph = 7.5) la incolor (ph = 6.5). reactia a fost urmarita pe intervalul unei unitati de ph.

Tampon - s-a folosit 4-2-hydroxy ethyl) - 1 -piperazine - ethane sulphonic acid (Hepes) având pKa = 7.83. s-a utilizat o concentratie de 20mM, iar ph-ul initial al solutiei a fost adus la 7.5.

Solutia stoc de AC, s-au preparat solutii stoc de AC I respectiv AC II în concentratii de 3.44x10^-6M. Concentratiile de AC au fost verificate prin masurarea spectrofotometrica la 280nm, cunoscând coeficientul de extinctie E²⁸⁰_1% = 19²¹.

Solutia de CO₂ se obtine prin barbotarea pâna la saturare a CO₂ gaz în apa bidistilata. Solutia astfel obtinuta este pastrata într-un vas închis, sub presiune, iar concentratia delucru este de 15mM. Aceasta concentratie se determina spectrofotometric la 340 nm printr-o metoda enzimatica care foloseste un chit de reactivi continând fosfoenol piruvat carboxilaza - maleat dehidrogenaza. Masuratorile s-au efectuat pe un analizator automat/ IMPACT 400 (Gilford, USA).

Na₂SO₄ în concentratie de 0.1 M pentru mentinerea constanta a tariei ionice-

Solutii stoc de activatori sau inhibitori preparate în concentratii de 2x10^-2 M, prin solubilizarea substantelor respective în apa bidistilata sau în dimetil sulfoxid si ajustarea ph-ului la 7.5.

Toti reactivii luati în lucru au ph-ul de 7.5 masurat cu ph-metrul Corning (Ciba Corning - Anglia).

S-a determinat activitatea AC I din hematii înainte, la 15 minute si la doua ore dupa administrarea substantelor.

Determinarile s-au efectuat la 150 de voluntari sanatosi, care au fost randomizati în 3 loturi, fiecare lot primind fie substante betaadrenergice, fie substante beta blocante. Partea a doua a studiului s-a realizat pe animale. Studiile in vivo au fost efectuate în acord cu Declaratia de la Helsinki privind drepturile pacientilor, fiind obtinute consimatămintele fiecarui pacient pentru introducerea sa in studiu.

Rezultate:   Studii pe voluntari sanatosi:

S-au ales 150 voluntari sanatosi, de sex masculin, fara nici o medicatie cronica, cu vârste între 30 si 50 de ani, care au fost randomizati în 3 loturi dupa cum urmeaza:

      Lotul A, 50 de voluntari cu vârsta medie de 41.7 ani carora li s-a administrat intra venos 4 g noradrenalina/minut, timp de 30 de minute;

      Lotul B, 50 de voluntari cu vârsta medie de 42.1 ani, carora li s-a administrat orciprenalina intra venos 0.5 mg;

      Lotul C, 50 de voluntari cu vârsta medie de 40.6 ani, carora li s-a administrat 5 mg propranolol per os.

Tabelul 1. Activitatea AC   din hematii, initial, la 15 minute si la doua ore

Fig. 1 Activitatea AC   din hematii: initial, la 15 minute si la doua ore

Noradrenalina si orciprenalina cresc activitatea AC din hematii cu 45% respectv 52% la doua ore de la administrare.

Propranololul scade activitatea AC din hematii cu 52%.

Studii pe animale:

S-au ales patru loturi de iepuri care au primit noradrenalina, orciprenalina, izoprenalina si propranolol.

      Lotul A, 50 de iepuri, a primit noradrenalina si a fost împartit în doua subgrupe:

      Grupul 1, 25 de iepuri, a primit 0.5 g noradrenalina/minut timp de 60 minute;

      Grupul 2, 25 de iepuri, a primit 1 g noradrenalina/minut timp de 60 minute;

      Lotul B, 50 de iepuri, a primit orciprenalina si a fost împartit în doua subgrupe:

      Grupul 1, 25 de iepuri, a primit orciprenalina intra venos în doza de 0.05 mg;

      Grupul 2, 25 de iepuri, a primit orciprenalina intravenos în doza de 1 mg;

      Grupul C, 50 de iepuri, a primit izoprenalina intravenos si a fost împartit în doua subgrupe:

      Grupul 1, 25 de iepuri, a primit izoprenalina în doza de 1mg;

      Grupul 2, 25 de iepuri, a primit izoprenalina în doza de 5 mg;

      Grupul D, 50 de iepuri, a primit propanolol si a fost împartit în doua subgrupe:

      Grupul 1, 25 de iepuri, a primit propranolol în doza de 0.5 mg;

      Grupul 2, 25 de iepuri, a primit propranolol în doza de 1 mg.

Determinarile s-au efectuat dupa metoda stoped flow descrisa anterior.

S-a determinat activitatea AC I din hematii înainte, la 15 minute si la 60 de minute dupa administrarea substantelor.

Tabelul 2. Modificarile activitatii AC din hematii la loturile de iepuri tratati cu noradrenalina, oricprenalina, izoprenalina si propanolol, în functie de doza.

Fig. 2 Modificarile activitatii AC din hematii la loturile de iepuri tratati cu noradrenalina, oricprenalina, izoprenalina si propanolol, în functie de doza.

Administrarea noradrenalinei, orciprenalinei si izoprenalinei în doze progresive, creste activitatea AC din hematii corespunzator cu doza.

Rezultatele sugereaza ca activarea AC prin agonisti alfa si beta drenergici produc modificari ale ph-ului intacelular cu consecinte asupra activarii adenilat si guanilat ciclazei, enzime cuplate functional cu activitatea AC, având ca rezultat producerea vasoconstrictiei. AC moduleaza raspunsul celular la catecolamine prin modificarile de ph. Astfel, cresterea activitatii AC scade ph-ul intracelular, cu scaderea consecutiva a acumularii de cGMP si vasoconstrictie. Inhibitia AC creste ph-ul intracelular urmat de acumularea de cGMP si cAMP, urmat de vasodilatatie.

Studii efectuate au aratat ca antagonistii receptorilor beta si alfa₂ sunt cei mai puternici inhibitori ai AC I. De altfel, receptorii alfa₂ inhiba adenilat ciclaza prin proteina G_I, activând în acelati timp fosfolipaza C. (11, 12, 13)

Activarea AC I se coreleaza cu efectele vasoconstrictoare cunoscute ale adrenalinei si noradrenalinei.

Scaderea actvitatii prodsa de propanolol si antagonizarea acestui efect prin adrenalina si noradrenalina, sugereaza implicatiile AC I în modularea tonusului vascular reglat de agonistii si antagonistii adrenergici.

Concluzii

În urma studiilor in vivo descrise mai sus, putem concluziona urmatoarele:

Agonistii beta si alfa adrenergici activeaza AC I si II.

Antagonistii alfa si beta drenergici inhiba AC I si II.

Rezultatele duc la concluzia ca AC este implicata în modularea tonusului vascular reglat de agonistii si antagonistii adrenetrgici.

Mecanismele prin care AC influenteaza tonusul vascular ar putea fi produs prin modificarile de pH pe care activarea sau inhibitia enzimei le antreneaza asupra receptorilor adrenergici prin acesti agonisti sau antagonisti. Aceste modificari initiate de AC, ar putea avea consecinte asupra activitatii întregului lant enzimatic celular cuplat cu AC, putând vorbi de un cuplaj functional între AC si receptorii adrenergici.

Bibliografie

Puscas I. si colab "Anhidraza carbonica si modularea proceselor fiziologice si patologice in organism - activatorii si inhibitorii enzimei" Ed. Helicon, Timisoara 1994

Cotecchia S. et al: Molecular cloning and expression of the cDNA for the hamster α1-adrenergic receptor, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988, 85, 7159-7163

Kobilka BK (1987). Cloning, sequencing and expression of the gene coding for the human platelet alpha1-adrenergic receptor. Science, 238: 650-656.

Friellet T. et al: Cloning of the cDNA for the human beta-one-adrenergic receptor, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987, 84, 7920-7924

Emorine L.J. et al: Molecular characteriyation of the human beta 3 adrenergic receptor, Science, 1989, 245, 1118-1121

Yarden Y. et al: The avian beta adrenergic receptor: primary structure and membrane topology, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1986, 83, 6795-6799

Birnbaumer L., Codina J., Mattera K., Cerione R.A., Hildebrandt J.D., Sunyer T., Rojas F.J., Caron M.G., Lefkowitz R.J., Iyenger R. "Molecular mechanism of transmembrane signaling", Ed. S. Cohen, Elsevier, New York, 1985, 131-182

Davey M (1986). Alpha adrenoceptors - an overview. Journal of Molecular and Cellular Cardiology, 18 (Suppl 5): 1-15.

Lindskog S., Wistrand P.J. in: "Desine of enyzme inhibitors as drugs", M. Sandler, Oxford University Ed., Oxford, 1987, 698-723

Khalifah RG (1971). The carbon dioxide hydration activity of carbonic anhydrase: stop-flow kinetic studies on the native human isozymes B and C. Journal of Biological Chemistry, 246: 2561-2573.

Puscas I, Pasca R, Lazoc L & Kun C (1994). Effects of alpha- and beta-adrenergic agonists and antagonists on carbonic anhydrase. In: Puscas I (Editor), Carbonic Anhydrase and Modulation of Physiologic and Pathologic Processes in the Organism. Helicon Publisher House, Timisoara, Romania, 260-268.

Puscas I, Buzas G & Moldovan A (1985). Effect of beta-adrenergic agonists and antagonists on carbonic anhydrase. Revue Roumaine de Biochemie, 22: 157-163.

Puscas I. si colab "Anhidraza carbonica si modularea proceselor fiziologice si patologice in organism - activatorii si inhibitorii enzimei" Ed. Helicon, Timisoara 1994